β-甘露聚糖酶（β-mannase：EC 3.2.1.78）是一类能够水解含有β-1,4糖苷键的内切型半纤维素酶，产物中以聚合度2~10的甘露寡糖和甘露糖为主。甘露寡糖主链由β-1,4-吡喃糖苷键构成，侧链通过葡萄糖、半乳糖以α/β-1,6糖苷键连接。根据主链和侧链的构造不同共分为四大家族：纯甘露聚糖（mannose）、葡甘露聚糖（glucomannan）、半乳甘露聚糖（galactomannan）和半乳葡甘露聚糖（galactoglucomannan）。甘露寡糖能够防止肥胖者体重增加，降低脂肪，减少肝脏脂肪变性，改善葡萄糖耐受性[1]，辅助降低血糖并调节肠道菌群[2]。甘露寡糖可以促进动物肠道中双歧杆菌、乳杆菌增殖、肠道表皮细胞分化，调节相关代谢通路，提高机体免疫力和抗氧化能力[3]。根据酶与底物之间特异性识别位点或催化机制的不同，甘露聚糖酶被分为GH5、GH26、GH113和GH134四个家族，主要来源于植物、细菌、真菌和动物，但是性质优良、种类繁多的β-甘露聚糖酶主要来源于微生物[4-6]。制备养殖行业生物颗粒饲料需要甘露聚糖酶能够耐超过80 ℃的高温。因此，研究耐高温[7]、耐酸性[8]、能够长时间保持较高酶活的甘露聚糖酶成为热点。研究耐高温的甘露聚糖酶能够解决成本问题，提高生物资源的利用率。本研究旨在筛选耐高温，可降解魔芋葡甘聚糖、半乳甘露聚糖为低聚寡糖的菌株，提高魔芋、角豆胶的利用价值。1材料与方法1.1材料与仪器毕赤酵母GS115、质粒pPIC9K，枯草芽孢杆菌DL4实验室前期筛选并保存，ExTaq DNA polymerase、DL15000 bp Marker、蛋白电泳Marker；细菌基因组DNA提取试剂盒购自擎科生物技术公司；魔芋粉、DNA凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自Sigma公司。PCR仪购自东胜创新公司；摇床购自上海通特电讯设备厂；核酸电泳仪购自美国Bio-Rad公司；凝胶成像仪购自美国Bio-Rad公司；蛋白电泳仪购自美国Amersham Bioscience公司。1.2培养基YPD、BMGY、BMMY培养基均参照Multi-Copy Pichia Expression Kit操作手册制备。1.3试验方法1.3.1重组甘露聚糖酶基因克隆及表达载体构建依据擎科细菌DNA提取试剂盒的方法从B. subtilis DL4中提取基因组DNA，根据NCBI数据库里的β-甘露聚糖酶基因序列及表达载体pPIC9K的多克隆位点设计引物。引物设计如下：上游引物DL4man-F：5'-GCTGAAGCTTACGTAGAATTCCATACTGTGTCGCCTGTGAATCC-3'，下游引物DL4man-R：5'-AAGGCGAATTAATTCGCGGCCGCTTCAACGATTGGCGTTAAAGAA-3’（下划线处分别为EcoR1和Not1酶切位点）。PCR反应体系：1 μL基因组DNA模板、5 μL 10×buffer、2.5 μL dNTPs、1.25 μL DL4man-F（10 μmol/L）、1.25 μL DL4man-R（10 μmol/L），0.625 μL ExTaq DNA polymerase，ddH2O补足至50 μL。PCR扩增反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，28个循环。PCR产物使用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，回收扩增产物送至北京擎科生物技术有限公司测序。将质粒pPIC9K经EcoRⅠ和NotⅠ双酶切，胶回收线性化载体，利用One Step Clonging Kit连接技术将目的基因连接至线性化载体，转化至E.coli DH5α感受态细胞，涂布于含50 mg/L卡那LB平板上，37 ℃，180 r/min，培养14 h，筛选阳性转化子送至北京擎科生物技术有限公司测序，将连接正确的克隆载体命名为pPIC9K-DL4man。1.3.2重组蛋白甘露聚糖酶的表达与纯化将重组表达载体pPIC9K-DL4man电转入表达宿主毕赤酵母GS115感受态细胞中，使用YEPD平板筛选出正确的转化子，配置酵母发酵培养基，利用甲醇为诱导剂在30 ℃，180 r/min培养48 h，离心，利用透析，超滤进行分离纯化。1.3.3重组甘露聚糖酶酶活力酶活力定义：以每分钟水解角豆胶产生1 μmol还原糖的酶量定义为1个酶活单位（U/mL）。酶活力的测定方法采用DNS法，即在碱性条件下，二硝基水杨酸（DNS）与甘露聚糖酶催化角豆胶生成的还原糖发生氧化还原反应，生成3-氨基-5-硝基水杨酸，该产物在煮沸条件下显棕红色，于OD540 nm下可测定吸光度。重组蛋白分析采用SDS-PAGE，浓缩胶5%，分离胶12%。1.3.4重组甘露聚糖酶酶学性质研究1.3.4.1最适pH值及pH值稳定性取适当稀释的酶液，1%的角豆胶作为底物，分别使用pH值3.0~12.0的缓冲液，在37 ℃下，采用DNS法测定重组甘露聚糖酶的最适pH值。pH值稳定性：将适当稀释的酶液置于不同pH值缓冲液中1 h，取出，在37 ℃，pH值5.5条件下采用DNS法测定重组甘露聚糖酶的剩余酶活，以酶活最高的作为100%，以下采用同种方法测定。1.3.4.2最适温度及温度稳定性取适当稀释的酶液，1%的角豆胶作为底物，分别于30~70 ℃，最适pH值条件下采用DNS法测定重组甘露聚糖酶的最适温度。研究重组甘露聚糖酶在不同温度下的稳定性，将酶液置于55、60、65、70、80 ℃下耐受100 min，每隔10 min取样，测定剩余酶活。1.3.4.3金属离子及有机试剂对重组甘露聚糖酶的影响在反应体系中加入金属离子使其终浓度为10 mmol/L，加入1%的有机试剂，在37 ℃和pH值5.5条件下研究其对重组甘露聚糖酶的活力影响，以未添加金属离子的试验组酶活作为100%。1.3.4.4重组甘露聚糖酶动力学参数测定配制不同浓度的角豆胶底物（0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、2.0%、2.5%），不同浓度的魔芋粉底物（0.6%、0.8%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%）按照DNS法测定重组甘露聚糖酶酶活。1.3.4.5胃-胰蛋白酶对重组酶活性的影响取适当稀释的重组甘露聚糖酶，分别加入同体积浓度为10 g/L的胃蛋白酶和胰蛋白酶[9]，37 ℃孵育30、60 min，使用同体积的水和酶液混合做对照，测定剩余酶活。以上数据均采用GraphPad Prism 5.01处理。1.3.5重组甘露聚糖酶水解角豆胶、魔芋粉产物分析使用pH值5.5、50 mmol/L的缓冲液配置5%的魔芋粉作为水解底物，按20 U/g的酶量添加，37 ℃水解8 h，沸水煮沸10 min终止反应，水解产物经12 000 r/min离心10 min，进行薄层层析和ESI-MS分析。薄层层析条件：配制展开剂，按冰乙酸∶双蒸水∶正丁醇2∶2∶4比例吸取后混合均匀，将配好的展开剂倒入展开槽中，静置10 min。提前将烘箱升高至110 ℃，将硅胶板放烘箱活化约30 min，冷却，在距硅胶板的底部约1 cm的地方画一条直线，在线上每隔1 cm点样，每次点0.5 μL，重复3次。将硅胶板放入到展开剂中，待展开剂在硅胶板上展开到离硅胶板上端约1.5 cm处，取出硅胶板并吹干，放入展开剂中展开1次后吹干。配制显色剂，准确称取1 g二苯胺溶于50 mL丙酮中，充分溶解，加入1 mL苯胺、5 mL 85%的正磷酸，缓慢混匀直至白色絮状沉淀消失，将吹干的硅胶板放置显色剂中显色30 s，取出吹干，于90 ℃显色10~15 min。ESI-MS分析：送至云南联大科技产业有限责任公司。2结果与分析2.1目的基因扩增及重组载体构建通过PCR扩增获得一条特异性单一条带，PCR扩增结果见图1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.014.F001图1PCR扩增结果注：1为目的基因；M为Marker 2 000 bp。由图1可知，条带约为1 100 bp。将扩增产物经胶回收后送至北京擎科生物技术公司进行测序。测序结果通过NCBI数据库进行蛋白序列BLAST比对，DL4man多序列比对及三维结构见图2。图2DL4man多序列比对及三维结构10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.014.F2a1（a）DL4man多序列比对10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.014.F2a2（b）DL4man三维结构由图2可知，DL4与枯草芽孢杆菌中的β-甘露聚糖酶蛋白质序列具有高度一致性，最高分别达到98.64%（登录号：AWO72253.1）和98.62%（登录号：ACX94026.1），初步鉴定扩增的基因为β-甘露聚糖酶基因，将其命名为DL4man基因（登录号：MW357596）。氨基酸多序列比对结果显示，从B. subtilis DL4中获得的甘露聚糖酶基因序列与Bacillus subtilis来源的Bcman（pdb：2QHA）具有98.81%的相似度，根据Bcman的晶体结构和同源建模后的三维结构可知DL4为典型的（β/α）8折叠型。采用Pfam对该基因的结构域进行分析，结果表明，DL4man属于糖苷水解酶26家族。SignalP5.0信号肽预测结果显示，DL4man有一段长为31个氨基酸的信号肽序列。2.2重组甘露聚糖酶DL4man表达DL4man甘露聚糖酶重组蛋白SDS-PAGE电泳结果见图3。重组DL4man甘露聚糖酶经透析后在44.3 kDa附近有一条单一亮条带，与预期目的蛋白分子量41.5 kDa相符，通过计算可知重组蛋白DL4man甘露聚糖酶活力为100.5 U/mL。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.014.F003图3DL4man甘露聚糖酶重组蛋白SDS-PAGE电泳结果注：1为97.2蛋白Marker；2为空pPIC9K质粒发酵液；3为粗酶液；4为纯酶液。2.3重组甘露聚糖酶DL4man的酶学特性2.3.1DL4man甘露聚糖酶最适pH值及pH值稳定性（见图4）由图4可知，DL4man甘露聚糖酶在pH值5.0~6.5之间具有较高酶活，保持在80%以上，最适pH值为5.5。当pH值大于7.0或小于4.0时酶活较低，可以认为该酶属于中性甘露聚糖酶。酸碱度对酶功能的影响与酶底物复合物的形成有关，催化作用往往依赖于酶和底物上的电荷分布，而细菌来源的甘露聚糖酶在中性至碱性的pH值时具有最大活性。本研究中，在pH值5~11之间耐受1 h后，DL4man甘露聚糖酶的相对酶活保持在60%以上，具有较宽的pH值适应范围。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.014.F004图4DL4man甘露聚糖酶最适pH值及pH值稳定性（a） DL4man甘露聚糖酶最适pH值　（b） DL4man甘露聚糖酶pH值稳定性2.3.2DL4man甘露聚糖酶最适温度及温度稳定性（见图5）由图5可知，DL4man甘露聚糖酶的最适温度为55 ℃，在40~65 ℃间相对酶活保持在60%以上，从各种芽孢杆菌分离出的甘露聚糖酶在50~65 ℃范围内具有活性。将DL4man甘露聚糖酶置于不同温度下耐受100 min测定其剩余酶活力，在55、65 ℃下孵育100 min后，相对酶活力均在50%以上，70 ℃的半衰期为70 min，80 ℃下耐受100 min后剩余46%的酶活性。研究表明，该酶具有良好的热稳定性，因此更有利于工业生产。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.014.F005图5DL4man甘露聚糖酶最适温度及温度稳定性（a） DL4man甘露聚糖酶最适温度　（b） DL4man甘露聚糖酶温度稳定性2.3.3金属离子及有机试剂对β-甘露聚糖酶的活力影响（见表1）由表1可知，Mn2+、Na+、Mg2+、K+、Tritonx 100、10% EDTA、吐温80对DL4man甘露聚糖酶活有明显的促进作用，Co2+、Cu2+、Ca2+、Zn2+对DL4man甘露聚糖酶活影响较小，SDS、Fe3+完全抑制该酶活，Ag+、Ni+、Al3+对DL4man甘露聚糖酶活有抑制作用。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.014.T001表1金属离子及有机试剂对β-甘露聚糖酶活力的影响项目相对酶活CK100.00±3.95SDS3.57±0.53Ag+31.53±1.49Mn2+141.75±0.78Na+111.89±1.37Ca2+87.78±2.57Cu2+88.413±1.37Mg2+106.61±1.49K+107.10±2.28Zn2+93.24±2.86Ag+98.53±3.33Ni+79.28±0.89Al3+65.82±3.90Fe3+1.24±1.52Tritonx-100113.87±1.1210% EDTA120.05±2.67吐温80119.15±1.44注：金属离子及有机试剂的终浓度均10 mmol/L。%2.3.4重组甘露聚糖酶的动力学参数（见表2）由表2可知，重组甘露聚糖酶以角豆胶为底物时，Km值为2.46，Vmax为537.60；以魔芋粉为底物的Km值为3.65，Vmax为917.20。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.014.T002表2重组甘露聚糖酶的动力学参数项目角豆胶魔芋粉Vmax/[μmol/(mL·min)]537.60917.20Km/(g/L)2.463.652.3.5不同甘露聚糖酶对胃-胰蛋白酶活性影响（见表3）由表3可知，经过60 min的胃蛋白酶耐受，本研究筛选的甘露聚糖酶的剩余酶活为96.73%，而商品酶A仅为93.53%；经过60 min的胰蛋白酶耐，本研究筛选的甘露聚糖酶的剩余酶活为89.67%，而商品酶B仅为85.52%。研究表明，本试验筛选的甘露聚糖酶具有良好的胃-胰蛋白耐受性。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.014.T003表3不同甘露聚糖酶对胃-胰蛋白酶活性影响项目胃蛋白酶胰蛋白酶商品酶A商品酶B重组甘露聚糖酶商品酶A商品酶B重组甘露聚糖酶30 min98.18ab99.18a97.12b90.78b91.80b96.14a60 min93.53b98.54a96.73ab88.25ab85.52b89.67a注：同行数据肩标相同字母表示差异不显著（P0.05），不同字母表示差异显著（P0.05）。%2.4DL4man甘露聚糖酶水解角豆胶、魔芋粉产物分析（见图6）由图6可知，当酶解角豆胶时间为10 min时，产物中已经生成甘露二糖、甘露三糖、甘露四糖，在酶解30 min后产物中生成甘露五糖，酶解8 h后产物中有聚合度2、3、4、5的甘露糖。根据质谱图可知主要成分为甘露二糖和甘露三糖，而水解魔芋粉的主要产物是聚合度为2、3的甘露寡糖。图6DL4man甘露聚糖酶水解角豆胶、魔芋粉产物分析注：M1为甘露糖；M2为甘露二糖；M3为甘露三糖；M4为甘露四糖；M5为甘露五糖；M6为甘露六糖。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.014.F6a1（a）DL4man甘露聚糖酶水解角豆胶薄层层析10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.014.F6a2（b）角豆胶水解产物ESI-MS分析10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.014.F6a3（c）DL4man甘露聚糖酶水解魔芋粉薄层层析10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.014.F6a4（d）魔芋粉水解产物ESI-MS分析3讨论目前，通过基因工程技术已经成功实现了甘露聚糖酶在芽孢杆菌[10]、毕赤酵母[11-12]中的异源表达，并且已在分子生物学层面通过分子伴侣共表达[13]、基因剂量调整[14]、定点突变[15]、N端糖基化修饰[16]等策略改善酶学性质。该重组甘露聚糖酶DL4man的最适温度为55 ℃，低于GH26家族的类芽孢杆菌（60 ℃）[17]，高于环状芽孢杆菌NT6.7（50 ℃）和枯草芽孢杆菌B23（50 ℃）[18]，低于嗜碱芽孢杆菌N16-5（70 ℃）[19]。该酶在55~65 ℃能够保持90%以上的酶活，在70 ℃耐受70 min后依旧具有50%以上的酶活，80 ℃下耐受100 min后仍然具有46%的酶活。DL4man具有较高的温度稳定性主要取决于结构中存在的二硫键（Cys97=Cys117）以及特殊的金属离子结合位点（His32-His54-367Glu），与其他微生物来源[20-21]的甘露聚糖酶相比具有较好的温度耐受性。该重组甘露聚糖酶DL4man最适pH值为5.5，低于芽孢杆菌属MK-2（pH值6），高于类芽孢杆菌BME-14（pH值4.5）。甘露聚糖酶DL4man在高温、常温下均具有较高的酶活，可以同时满足工业颗粒饲料的制备以及常温下甘露寡糖的制备。来源枯草芽孢杆菌GH26家族的Bman26/MEIR β-甘露聚糖酶酶解聚合度大于4的甘露聚糖主要产生甘露二糖、甘露三糖及其少量的甘露糖，缺乏糖苷酶活性，因此不能将甘露二糖水解为甘露糖[22]，与本研究的重组甘露聚糖酶DL4man水解角豆胶的产物组分相似。本研究中，角豆胶水解产物为甘露二糖、甘露三糖、甘露四糖、甘露五糖，更有利于甘露寡糖的积累，提高甘露寡糖的产量。本研究中，水解魔芋粉的产物组分主要为甘露二糖和甘露三糖。而来源于Penicillium chrysogenum的β-甘露聚糖水解魔芋粉的主要产物中除了聚合度大于4的甘露寡糖外，还有少量甘露糖[23]。因此，不同来源的甘露聚糖酶酶解相同的底物，产物组分也有所不同，不同结构的酶与底物的结合有所差别，糖苷键的断裂也存在差异。在肠道中，相对于高聚合度的寡糖而言，低聚合度的寡糖优先被乳酸菌利用产生乳酸[24]，促进乳酸菌的生长[25]，调节肠道健康。4结论研究通过在魔芋基地筛选出1株产甘露聚糖酶菌株DL4，经分子生物学鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌，命名为B. subtilis DL4。甘露聚糖酶基因在毕赤酵母GS115中表达后在70、80 ℃下表现出很好的温度稳定性，70 ℃的半衰期为70 min，80 ℃下耐受100 min后剩余46%的酶活性，具有较好的胃-胰蛋白酶抗性，能够稳定地在胃肠道中发挥作用。该酶可以利用魔芋粉、角豆胶制备甘露寡糖，为功能性甘露寡糖的制备提供参考。