我国畜牧业的养殖模式由散养向集约化、规模化方向改变，但抗生素、化学制剂等的使用量增加，造成药物残留[1]，导致动物胃肠道菌群失调[2]。研究发现，微生态制剂可以有效提高畜禽的生产性能，改善畜产品品质，具有无残留、无毒副作用[3]。微生态制剂作为抗生素的理想替代品，已经在畜牧业中广泛应用。微生态制剂可通过有益菌群成为优势菌群调整微生态平衡[4]。乳酸杆菌作为反刍动物瘤胃和肠道微生物的重要组成部分[5]，可以改变动物肠道环境，促进肠道健康[6]。乳酸杆菌的产酸性能对机体的天然免疫起促进作用[7]。乳酸杆菌制剂可以替代抗生素，用于预防和治疗细菌性腹泻[8]，有效避免过度使用抗生素产生耐药菌株的情况，是目前应用的一类较广泛的微生态制剂[9]。菌株的筛选和益生活性的测定是微生态制剂开发研究的关键，决定微生态制剂的使用效果[10]。因此，本研究从藏羊肠道内容物中分离鉴定乳酸杆菌，利用抑菌、耐高温、抗酸碱、对药物敏感性等试验研究其益生特点，以期为高效、无残留、无毒副作用、无污染的藏羊乳酸杆菌微生态制剂的开发提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1指示菌菌株大肠杆菌（el-qh）、沙门氏菌（sl-qh）、金黄色葡萄球菌（sa-qh）、产气荚膜梭菌（cp-qh）等青海分离株由青海大学农牧学院青藏高原动物疾病研究室保存。1.1.2样品来源藏羊胃肠内容物采自青海省海北藏族自治州祁连亿达畜产肉食品公司。1.1.3试验试剂MRS琼脂、MRS肉汤、胰蛋白胨大豆肉汤、乳酸杆菌生化鉴定套装，均购自北京路桥技术股份有限公司；药敏纸片购自杭州微生物试剂有限公司。1.2试验方法1.2.1增菌无菌操作将藏羊肠内容物置于胰蛋白胨大豆肉汤中，37 ℃恒温厌氧培养16~24 h。1.2.2细菌分离纯化及形态学观察接种环蘸取增菌液划线于MRS琼脂，置于厌氧培养盒中，37 ℃恒温厌氧培养24 h。挑取颜色、大小、边缘情况等不同的单菌落在MRS琼脂上反复划线，镜检观察菌落的形态结构，检验是否纯化。1.2.3分离菌株的生化鉴定将分离纯化的乳酸杆菌分别接种于乳酸杆菌生化鉴定套装的培养基中，参照《伯杰细菌鉴定手册》[11]和《乳酸菌分类鉴定及实验方法》[12]中乳酸杆菌种属的生理生化鉴定特征对分离菌株进行鉴定，根据细菌微量生化鉴定管使用说明书进行操作。1.2.4分离菌株16S rDNA分子生物学鉴定基因组DNA提取：分离株菌液按照试剂盒（宝日医生物技术(北京)有限公司）说明书提取基因组DNA。16S rDNA基因PCR扩增：以提取DNA为模板，利用16S rDNA通用引物进行基因扩增，预期产物长度为1 500 bp。扩增体系：Premix Taq 25 μL、上下游引物各1 μL、基因组DNA 0.5 μL、ddH2O补足至50 μL；扩增条件：95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，35个循环；72 ℃ 5 min。琼脂糖凝胶电泳检测，PCR产物送至北京奥维森基因科技有限公司测序。1.2.5乳酸杆菌分离菌株抑菌能力的测定利用牛津杯法测定乳酸杆菌分离菌株对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌以及产气荚膜梭菌的抑菌能力。吸取致病菌菌液涂布在营养琼脂上，放置牛津杯，向牛津杯中分别加分离菌株上清液，4 ℃冰箱中预扩散12 h，37 ℃恒温培养12 h，使用游标卡尺测量抑菌圈直径，每个样品做3次重复，结果取平均值。1.2.6乳酸杆菌分离株耐受性试验1.2.6.1耐酸碱试验将乳酸杆菌分离菌株菌液分别按2%接种量接种至pH值1.0、2.0、3.0、4.0、7.0和8.0的MRS肉汤中，170 r/min 37 ℃恒温培养，分别在4、16 h取0.9 mL菌液和0.1 mL生理盐水进行梯度稀释，取3个适宜稀释度菌液各0.1 mL，涂布MRS固体培养基，做3次重复，利用平板计数法进行菌落计数[13]。1.2.6.2耐高温试验将乳酸杆菌分离菌株菌液分别以2%接种量接种在MRS肉汤中，分别在37、40、60、80 °C水浴30 min，170 r/min、37 ℃恒温培养16 h，分别水浴30 min和恒温培养16 h，取0.9 mL菌液和0.1 mL生理盐水进行梯度稀释，取3个适宜稀释度菌液各0.1 mL，涂布MRS固体培养基，做3次重复，利用平板计数法进行菌落计数。1.2.7生长曲线和产酸能力曲线的测定将乳酸杆菌分离菌株菌液分别按2%的接种量接种至MRS肉汤中，170 r/min、37 °C恒温培养24 h，每2 h取样1次。使用紫外可见分光光度计测定600 nm波长处待测样品的吸光值，并测定pH值，记录测定数据并绘制生长曲线和产酸能力曲线。1.2.8药物敏感性试验将乳酸杆菌分离菌株菌液分别均匀涂布于MRS平板培养基上，利用纸片扩散法将药敏纸片均匀置于平板上，37 ℃培养24 h，利用游标卡尺测定20种抗生素对3种分离菌株的抑菌圈，对药敏性进行判定。2结果与分析2.1细菌分离纯化及形态学观察革兰氏染色镜检结果见图1。由图1可知，经分离培养筛选出1株革兰氏阳性杆菌，菌株菌落均呈圆形、表面凸起、乳白色、边缘整齐光滑。LS-ql的镜检结果呈紫色，长杆状且较细，单个、成对或短链状排列，无芽孢。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.015.F001图1革兰氏染色镜检结果（100×）2.2分离菌株鉴定结果2.2.1生化鉴定乳酸杆菌种的鉴定主要是进行糖醇类发酵产酸试验，该分离菌株可以发酵纤维二糖、麦芽糖、蔗糖和乳糖，无法利用棉籽糖和菊糖；甘露醇、水杨苷、山梨醇试验表现为阳性，七叶苷试验、1%马尿酸钠试验均为阴性，符合乳酸杆菌的生理生化特征。2.2.2分子鉴定结果16S rDNA基因扩增结果及序列分析见图2、图3。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.015.F002图2分离菌株的16S rDNA PCR电泳扩增结果注：M为DL2000DNA标记物，1为基因LS-ql。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.015.F003图3分离株16S rDNA序列与参考序列遗传进化树由图2可知，分离菌株PCR扩增结果为约1 500 bp的16S rDNA的基因片段。测序结果表明，LS-ql的长度为1 480 bp。将测序结果与Gen Bank里的基因序列采用BLAST软件进行同源性比对分析。由图3可知，LS-ql与沙克乳酸杆菌参考序列最相似，相似度达99%以上。结合该菌的形态特征以及生理生化鉴定结果，鉴定LS-ql为沙克乳酸杆菌。2.3抑菌能力测定结果（见表1）由表1可知，沙克乳酸杆菌对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、产气荚膜梭菌分离株均具有一定的抑制作用，抑菌圈直径均超过10 mm，且LS-ql对大肠杆菌的抑制能力最强。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.015.T001表1抑菌能力测定结果项目抑菌圈直径平均值大肠杆菌沙门氏菌金黄色葡萄球菌产气荚膜梭菌LS-ql16.2215.1815.9714.34mm2.4乳酸杆菌分离株耐受性试验结果2.4.1耐酸碱试验分离菌株在培养4 h、pH值3.0和4.0的条件下均能够生长，说明沙克乳酸杆菌能够耐受pH值3.0的环境；培养16 h、pH值3.0沙克乳酸杆菌仍然能够存活。分离菌株在pH值8.0，培养4和16 h均能够增殖生长，且活菌浓度较高。因此，沙克乳酸杆菌具有较强的耐酸能力和一定的耐碱能力。2.4.2耐高温试验分离菌株随水浴温度的逐渐升高，活菌浓度均先小幅度升高后降低。各菌株在37 ℃和40 ℃时增殖效果较好，活菌浓度升高；60 ℃和80 ℃水浴30 min活菌浓度明显减少，经170 r/min、37 ℃恒温厌氧培养16 h活菌浓度又升高。结果表明，沙克乳酸杆菌耐高温能力较强。2.5生长曲线和产酸能力曲线（见图4）由图4可知，分离菌株生长速度较快，0~4 h均处于延滞期，生长缓慢；4 h后进入对数生长期，生长速度急剧加快；12 h后进入稳定期，生长速度变缓；22 h后进入衰亡期。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.015.F004图4生长代谢曲线和产酸能力曲线分离菌株的产酸能力曲线和生长代谢曲线密切相关，随着菌株的生长代谢，有机酸含量逐渐增多，pH值逐渐降低。分离菌株4 h后进入对数生长期，产酸能力快速增强。2.6乳酸杆菌对不同药物的敏感性试验结果（见表2）由表2可知，分离菌株对新霉素、青霉素、头孢哌酮、头孢唑啉、氨苄西林、庆大霉素、头孢呋辛、羧苄西林、红霉素、卡那霉素、哌拉西林11种药物表现敏感，只对某些四环素类药物和第一代头孢菌素类药物表现耐药，说明沙克乳酸杆菌对药物敏感性较高。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.015.T002表2乳酸杆菌对不同药物的敏感性试验结果项目药物含量/(μg/片)判断结果新霉素30S头孢曲松30R头孢氨苄30R青霉素10S四环素30R头孢哌酮75S头孢唑啉30S苯唑西林1R多西环素30R丁胺卡那30I头孢拉定30R氨苄西林10S米诺环素30R庆大霉素10S头孢呋辛30S羧苄西林100S红霉素15S卡那霉素30S头孢他啶30R哌拉西林100S注：R表示耐药，S表示敏感，I表示中度敏感。3讨论关于猪源和鸡源中乳酸杆菌的分离鉴定及体外益生特性研究较多。梁东梅等[14]以健康猪肠道内容物为样品来源获得植物、唾液、嗜酸乳杆菌。刘小兰等[15]以鸡肠道内容物为样品来源获得益生特性良好的唾液乳杆菌，而以藏羊内容物为来源的研究较少。乳酸杆菌可以耐受胃肠道环境，发挥其有益作用[16-18]。因此，菌株的耐酸特性对菌株作为益生菌制剂具有重要的参考意义。本研究耐酸碱试验结果显示，分离菌株对pH值变化的耐受性良好，沙克乳酸杆菌能够在pH值3.0和pH值8.0的环境中存活，与何江波等[9]从羊瘤胃内容物分离出的乳酸杆菌可以耐受pH值3.0环境的研究结果一致。杨传强等[19]通过体外乳酸杆菌分离株耐受强酸的试验，挑选出的菌株可以抵抗牦牛胃中的低pH值等不利条件，到达消化道内仍能够维持较多的活菌数量。乳酸杆菌的生长速度及产酸能力作为筛选益生菌的重要指标。生长速度快能够使菌株迅速繁殖成为优势菌群，竞争性抑制其他病原微生物的生长。菌株产酸能力强能够快速产生大量乳酸等有机酸，形成低pH值环境，抑制有害菌的生长[20]；且乳酸菌生长过程中可以通过产生具有抑菌性代谢产物（如细菌素）直接抑制某些病原菌的增殖[21]。本试验分离的沙克乳酸杆菌具有生长速度快、产酸能力强的特点，对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、产气荚膜梭菌均具有一定的抑制作用。易力等[22]研究表明，乳酸菌对大肠杆菌具有明显的抑制作用。王欣等[23]研究表明，乳酸菌对有害菌（沙门氏菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌）具有抑制作用，与本试验研究结果基本一致。4结论本研究分离鉴定出的一株益生特性良好的沙克乳酸杆菌，对酸碱、高温环境均具有较强耐受性，抑菌能力较强，生长速度和产酸能力也较强，可以为制备藏羊源微生态制剂提供良好的基础菌株。