中国饲料产量的年复合增长率为6.1%[1]。饲料中长期使用抗生素会导致多种病原菌产生耐药性[2]。因此，2020年7月1日起全国饲料生产企业停止生产含有抗生素的商品饲料[3-4]。抗生素在饲料中的特殊功能主要包括促生长、抑菌和抗病[5]。研究发现，细菌素具有与抗生素相似的作用[6]，具有无毒、无害、抗药性强等作用。因此，在饲料行业中，细菌素可以部分减少甚至取代抗生素的使用[7]。副干酪乳杆菌是益生类乳酸菌，作为动物肠道中的优势菌株，副干酪乳杆菌可以产生乳酸细菌素抑菌抗菌，维持宿主胃肠道菌群平衡，合成分泌蛋白酶等消化酶，促进动物消化吸收；副干酪乳杆菌还可以合成氨基酸、维生素等营养物质[8-9]。Lukic等[10]将副干酪乳杆菌BGHN14作为饲料添加剂，结果发现，鱼粉中短肽、可溶性蛋白等营养物质显著提高，水产品饲料品质提升。Trasino等[11]使用副干酪乳杆菌HFPB饲养高脂动物，结果发现，动物血清中的胆固醇明显降低，证明菌株具有调节AM胆固醇代谢的功能。因此，寻找“绿色、安全、高效”的添加剂替代抗生素是解决集约化养殖过程中因大肠杆菌等病原菌引起的流行性疾病的重要措施[12]。本试验以麸皮为固体发酵基质，对副干酪乳杆菌SLP16发酵条件进行优化，为研发新型的替抗饲料添加剂提供参考。1材料与方法1.1试验材料硫酸铵、硫酸镁等购自西陇科学股份有限公司；乙醇、50%戊二醛购自成都市科龙化学品有限公司。GC-MS气相色谱-质谱联用仪购自安捷伦科技有限公司；VEGA 3SBU扫描电子显微镜购自翱艺仪器有限公司；CJ-2D超净工作台购自天津泰斯特仪器有限公司。改良MRS培养基：大豆蛋白胨11.63 g、牛肉膏10 g、酵母粉5 g、葡萄糖20 g、乙酸钠7.02 g、柠檬酸氢二铵2 g、磷酸二氢钾2 g、硫酸镁0.78 g、硫酸锰0.25 g、吐温-80 1 mL、蒸馏水1 000 mL。副干酪乳杆菌前期从浓香型百年窖池窖泥中筛选获得，已进行鉴定和基因组学的相关分析，保存于广东省微生物菌种保藏中心。1.2抑菌试验1.2.1指示菌菌悬液的制备将金黄色葡萄球菌从斜面接种至牛肉膏蛋白胨液体培养基中，使用同样的方法将大肠杆菌接种至LB液体培养基中，37 ℃、180 r/min培养24 h，将指示菌液稀释至浓度为106 CFU/mL。1.2.2限抗饲料添加剂及其细菌素的制备将副干酪乳杆菌（LAB）活化，37 ℃静置培养12 h，制成终浓度为106 CFU/mL LAB种子液，按体积分数5%接种量接种至固体发酵瓶中发酵，37 ℃静置培养24 h，获得限抗饲料添加剂，加入100 mL 0.01 mol/L盐酸溶液（比例为20 mL/g），37 ℃、180 r/min提取40 min，4 000 r/min离心10 min，上清液即为细菌素，4 ℃保存。1.2.3抑菌试验采用双层琼脂扩散法[13]进行抑菌试验，在无菌平板中倾倒10 mL的固体水琼脂培养基，待冷却凝固放上牛津杯，以体积分数7%接种量将指示菌菌悬液加入50 ℃的LB固体培养基中，混匀，将其倒在底层水琼脂上面，凝固，使用镊子取出牛津杯，形成孔洞，向每个孔中加入发酵提取液，4 ℃扩散30 min，37 ℃培养12 h。使用游标卡尺测量抑菌圈直径。1.3标准曲线及效价的测定抗生素、维生素、激素类生物制品采用生物试验方法与标准品比较检定普通药物质量规格，标定其效价[14]。1.3.1抑制革兰氏阳性指示菌效价的测定选用Nisin作为标准品进行抑菌试验。Nisin标准品的1个国际单位可换算成1微克（即1 IU=1 μg），效价指每1 mL或1 mg中所含的有效成分。将1 g Nisin标准品（效价900 IU/mg）溶解于1 mL 0.02 mol/L盐酸溶液中，配成9×104 IU/mL的Nisin标准液。以0.02 mol/L盐酸梯度稀释，稀释的效价分别为45 000、30 000、15 000、10 000、5 000、2 500、1 000、500 IU/mL。以Nisin效价的对数值作为横纵标，抑菌圈直径作为纵坐标，绘制效价标准曲线。以Nisin效价和多黏素B效价为标准测定发酵饲料添加剂的效价。X=10(Y+5.6738)/5.729/0.3×100/20(1)式中：X为每克发酵饲料效价，以log计；Y为抑菌圈直径（mm）；（Y+5.673 8）/5.729为Nisin效价标准曲线；0.3为抑菌圈试验样品添加量（mL）；100为提取液总体积（mL）；20为固体饲料质量（g）。1.3.2抑制革兰氏阴性指示菌效价的测定选用多黏素B作为标准品进行抑菌试验。多黏素B标准品的1个国际单位可换算成1微克（即1 IU=1 μg）。将100 mg 多黏素B标准品（效价6 000 IU/mg）溶解于1 mL 蒸馏水，配成6×105 IU/mL的多黏素B标准液。使用蒸馏水进行梯度稀释，稀释的效价分别为150 000 、100 000、50 000、25 000、10 000、5 000 IU/mL。以多黏素B效价的对数值作为横纵标，抑菌圈直径作为纵坐标，绘制效价标准曲线。计算多黏素B每克发酵饲料效价，同公式（1）。1.4正交法优化发酵条件1.4.1发酵基质的选取分别以豆渣、豆粕、麸皮、稻壳、油枯、小麦为发酵基质，考察副干酪乳杆菌SLP16对不同原料的利用率。装瓶量20 g/瓶，灭菌，补充无菌蒸馏水至液料比1 mL/g，将108 CFU/mL副干酪乳杆菌SLP16的种子液以总体积10%的接种量接种至灭菌后的固体发酵基质中，搅拌均匀，37 ℃培养箱发酵24 h，使用双层琼脂平板法做抑菌试验，测定各组抑菌圈，确定最佳发酵基质。1.4.2单因素试验在最优发酵基质上，考察液料比、发酵时间、发酵温度、接种量对发酵限抗饲料添加剂效价的影响。设定条件为固定接种量10%、发酵温度37 ℃、发酵时间1 d，考察发酵条件中不同液料比（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL/g）对发酵饲料效价的影响；设定条件为固定接种量10%、发酵温度37 ℃、液料比1 mL/g，考察发酵条件中不同发酵时间（1、2、3、4、5 d）对发酵饲料效价的影响；设定条件为固定接种量10%、液料比1 mL/g、发酵时间1 d，考察发酵条件中不同发酵温度（25、30、37、40、45 ℃）对发酵饲料效价的影响；设定条件为液料比1 mL/g、发酵时间1 d、发酵温度37℃，考察发酵条件中不同接种量（5%、10%、15%、20%、25%）对发酵饲料效价的影响；依据抑菌试验结果得到最优固态发酵条件作为正交设计的水平值。1.4.3正交试验根据单因素的结果，利用正交试验继续优化工艺条件，以接种量、发酵时间、液料比和发酵温度为考察因素，选取3个水平进行试验。采用L9(34)正交表进行正交试验设计，L9(34)正交试验因素水平设计见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.020.T001表1L9（34）正交试验因素水平设计水平A接种量/%B发酵时间/dC液料比/(mL/g)D发酵温度/℃1142.00.8362152.51.0373163.01.2381.4.4验证试验采用最优发酵条件进行验证试验，判断结果的可靠性，比较正交试验最优组和最优发酵条件下的抑菌圈直径和效价，确定最优发酵条件。1.5发酵限抗饲料添加剂抗氧化性的测定1.5.1发酵饲料抗氧化活性物质的提取参考张瑞等[15]的方法进行部分修改，测定发酵饲料添加剂抗氧化活性。准确称取1 g绝干物料等量的发酵饲料添加剂于研钵中，加入5 mL蒸馏水碾碎，室温下避光超声15 min，4 000 r/min离心10 min。收集上清液测定抗氧化活性。未发酵饲料作为空白对照，对比发酵前后的抗氧化活性。1.5.2DPPH自由基清除能力的测定参考刘之远等[16]的方法，将DPPH溶于乙醇溶液，配制成0.1 mmol/L的DPPH溶液，取1 mL待测样品加入2 mL DPPH溶液，混合均匀，室温避光保存40 min，517 nm处测量吸光度。DPPH自由基清除活性=[(AC-AS)/AC]×100%(2)式中：AS为样品组吸光度；AC为对照组吸光度。1.5.3还原能力的测定制备0.2 mol/L磷酸盐缓冲液，pH值6.6，1%三氯化铁、0.1%三氯化铁、10 %三氯乙酸，向0.5 mL样品中加入0.5 mL磷酸盐缓冲液和0.5 mL三氯化铁，50 ℃水浴20 min，冷却，加入0.5 mL三氯化铁，混匀，10 min后测定700 nm处吸光值[17]。吸光值越大，说明待测液体的还原能力越强。1.6发酵限抗饲料添加剂抑菌稳定性的测定[18]将新鲜的发酵限抗饲料添加剂放入37 ℃烘箱低温干燥，24 h取出，放入收纳袋进行常温保存。后期随机定时抽样，通过双层琼脂平板法测定发酵饲料的抑菌能力。2结果与分析2.1效价标准曲线2.1.1金黄色葡萄球菌效价标准曲线（抑制革兰氏阳性）Nisin效价的标准曲线见图1。由图1可知，回归方程为y=5.729x-5.673 8（R2=0.997 3）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.020.F001图1Nisin效价的标准曲线2.1.2大肠杆菌效价标准曲线（抑制革兰氏阴性）多黏素B效价的标准曲线见图2。由图2可知，回归方程为y=0.151 2x+1.151 9（R2=0.990 1）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.020.F002图2多黏素B效价的标准曲线2.2正交试验优化发酵条件2.2.1单因素试验2.2.1.1不同接种量对发酵饲料效价的影响（见图3）由图3可知，随着接种量的增大，发酵限抗饲料添加剂的效价先上升后下降。原因可能是接种量少的时候微生物生长需要足够的时间生长，同等时间抑菌活性较低，接种量过量的时候，微生物之间存在竞争抑制，营养物质有限，产生的抑菌活性较低。当接种量为15%时发酵限抗饲料添加剂对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌能力最强，效价值分别为6.21、5.77 lg(IU/g)。因此，选取15%作为最优接种量。图3不同接种量对发酵饲料效价的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.020.F3a1（a）金黄色葡萄球菌指示菌10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.020.F3a2（b）大肠杆菌指示菌2.2.1.2不同液料比对发酵饲料效价的影响（见图4）由图4可知，随液料比的上升，发酵限抗饲料添加剂的效价先上升后下降。原因可能是液料比太小或者太大均会使物料发酵不充分，导致其效价偏低。液料比为1 mL/g时，发酵限抗饲料添加剂对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌能力最强，效价值分别为6.35、5.66 lg(IU/g)。因此，选取液料比1 mL/g作为最优接种量。图4不同液料比对发酵饲料效价的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.020.F4a1（a）金黄色葡萄球菌指示菌10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.020.F4a2（b）大肠杆菌指示菌2.2.1.3不同发酵温度对发酵饲料效价的影响（见图5）由图5可知，随发酵温度的上升，发酵限抗饲料添加剂的效价先上升后下降。原因可能是低温和高温均会抑制微生物的生长，进而影响细菌素的产生，导致发酵限抗饲料添加剂效价降低。发酵温度为37 ℃时，发酵饲料对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌能力最强，效价值分别为6.32、5.77 lg(IU/g)。因此，选取37 ℃作为最优发酵温度。图5不同发酵温度对发酵饲料效价的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.020.F5a1（a）金黄色葡萄球菌指示菌10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.020.F5a2（b）大肠杆菌指示菌2.2.1.4不同发酵时间对发酵饲料效价的影响（见图6）由图6可知，随发酵时间的增加，发酵限抗饲料添加剂的效价先上升后平稳。原因可能是微生物生长发育合成细菌素需要一定时间，随着时间的增加，细菌素产量越来越高，但发酵瓶中的营养物质一定的，最终发酵限抗饲料添加剂的效价会达到一定的恒定值。发酵时间为第3 d时，发酵饲料对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌能力最强，效价值分别为6.32、5.58 lg(IU/g)。因此，选取发酵3 d为最优发酵时间。图6不同发酵时间对发酵饲料效价的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.020.F6a1（a）金黄色葡萄球菌指示菌10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.020.F6a2（b）大肠杆菌指示菌2.2.2正交试验优化发酵条件（见表2~表5）由表2可知，各因素对效价影响程度为ABCD，即接种量发酵时间液料比发酵温度。由k值可确定最佳发酵条件组合是A3B3C3D2，即接种量16%、液料比1.2 mL/g、发酵温度37 ℃、发酵时间3 d。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.020.T002表2Nisin效价正交试验结果项目ABCDNisin效价/lg(IU/g)114.002.000.8036.005.75214.002.501.0037.005.74314.003.001.2038.005.88415.002.001.0038.005.87515.002.501.2036.005.83615.003.000.8037.005.92716.002.001.2037.006.03816.002.500.8038.005.85916.003.001.0036.005.95k15.795.885.845.84k25.875.815.855.90k35.945.925.915.87R0.150.120.070.06由表3可知，接种量A和发酵时间B对效价影响极显著（P0.01），液料比C对效价影响显著（P0.05），发酵温度D对效价影响均不显著，与极差分析结果一致。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.020.T003表3Nisin效价方差分析结果项目平方和自由度均方F值显著性修正模型0.202a80.02510.5850.000 021截距929.9841929.984388 092.2960.000 000接种量0.10620.05322.1310.000 014发酵时间0.05520.02711.6330.000 571液料比0.02820.0145.9860.010 162发酵温度0.01220.0062.5910.102 511误差0.043180.002总计930.23027修正总计0.24626注：F临界值=3.03；表5与此同。由表4可知，各因素对效价影响程度为ABCD，即接种量发酵时间液料比发酵温度。由k值可确定最佳发酵条件组合是A3B3C3D2，即接种量16%、液料比1.2 mL/g、发酵温度37 ℃、发酵时间3 d。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.020.T004表4多黏素B效价正交试验结果项目ABCD多黏素B效价/lg(IU/g)114.002.000.8036.005.120214.002.501.0037.005.110314.003.001.2038.005.150415.002.001.0038.005.120515.002.501.2036.005.140615.003.000.8037.005.180716.002.001.2037.005.210816.002.500.8038.005.160916.003.001.0036.005.180k15.1275.1505.1535.147k25.1475.1375.1375.167k35.1835.1705.1675.143R0.0560.0330.0300.024由表5可知，接种量A对效价影响极显著（P0.01），发酵时间B对效价影响显著（P0.05），液料比C因素和发酵温度D对效价影响不显著，与极差分析结果一致。因此，最佳发酵条件为接种量16%，液料比1.2 mL/g、发酵温度37 ℃、发酵时间3 d。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.020.T005表5多黏素B效价方差分析结果项目平方和自由度均方F值显著性修正模型0.026a80.0035.3730.001 487截距716.7251716.7251 146 761.0130.000 000接种量0.01420.00711.8930.000 511发酵时间0.00520.0024.0530.035 212液料比0.00420.0023.2530.062 215发酵温度0.00220.0012.2930.129 653误差0.011180.001总计716.76427修正总计0.038262.2.3验证试验结果（见表6）由表6可知，经过验证试验确定最优发酵条件为接种量16 %、液料比1.2 mL/g、发酵温度37 ℃、发酵时间3 d。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.020.T006表6验证试验结果项目金黄色葡萄球抑菌圈/mmNisin效价/lg(IU/g)大肠杆菌抑菌圈/mm多黏素B效价/lg(IU/g）试验7号21.9±2.06.03±0.218.9±2.05.21±0.2优化条件25.0±2.06.58±0.222.0±1.05.70±0.32.3发酵饲料抗氧化物质分析（见表7）由表7可知，未发酵饲料添加剂本身存在一定的抗氧化物质，其DPPH自由基清除率为63.38%，A700 nm还原力为0.564。饲料添加剂经微生物发酵后，DPPH自由基清除率和还原力均明显增加。因此，麸皮饲料添加剂接种副干酪乳杆菌SLP16发酵后总抗氧化性能提高，为研发具有抗氧化特性的生物饲料提供参考。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.020.T007表7发酵饲料的抗氧化物质分析项目DPPH自由基清除率/%A700 nm还原力未发酵饲料添加剂63.38±2.000.564±0.020发酵饲料添加剂87.04±1.000.675±0.0102.4发酵限抗饲料添加剂抑菌稳定性的测定新鲜的发酵饲料需要有较强的抑菌能力，保证长时间的饲料运输和贮藏过程中不会因抑菌能力的断崖式下降而影响发酵饲料的品质。因此，发酵饲料抑菌能力稳定性试验必不可少。发酵饲料抑菌能力稳定性见图7。由图7可知，接种副干酪乳杆菌SLP 16的发酵限抗饲料添加剂，60 d常温保存过程中抑菌能力虽稍有降低，但抑菌能力一直保持在95%以上。因此，副干酪乳杆菌SLP 16发酵限抗饲料添加剂的抑菌能力稳定性良好，在60 d的常温保存期内依旧保持稳定的强抑菌能力。图7发酵饲料抑菌能力稳定性10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.020.F7a1（a）金黄色葡萄球菌指示菌10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.020.F7a2（b）大肠杆菌指示菌3结论本试验得到最优发酵条件为接种量16%、液料比1.2 mL/g、发酵温度37 ℃、发酵时间3 d。优化后的限抗发酵饲料添加剂，以金黄色葡萄球菌为指示菌，发酵饲料的抑菌圈直径为25.0 mm，效价为6.58 lg(IU/g)；以大肠杆菌为指示菌，发酵饲料的抑菌圈直径为22.0 mm，效价为5.70 lg(IU/g)。接种副干酪乳杆菌SLP 16的发酵限抗饲料添加剂抗氧化性明显提高，DPPH自由基清除率和还原力均明显增加。