随着饲料中禁止添加抗生素类药物相关政策的颁布，寻找新型替代抗生素产品是目前畜禽养殖中的重点。中药具有来源天然、方便易得、疗效明确、低药残等特点，是功能性饲用产品原料的较优选择[1-2]。连翘是中国传统中药，为木樨科植物连翘的干燥果实，是人体常用的清热解毒类药材[3-5]。连翘茎叶具有清热解毒的功能，主治心肺积热[6]。连翘叶中含有木脂素类、萜类、烯烃类、烷烃类、酚类、醇类、酯类、酮类等成分[7]，与连翘果实具有较高的相似性，具有抑菌、抗氧化、清除自由基、营养功能和提高免疫力等多种生物活性[8-11]。王玲芝等[12]研究表明，连翘叶提取物可有效提高大鼠免疫器官指数，预防高热中暑。陈贵宇等[13]研究表明，连翘叶乙醇提取物具有明显的抗小鼠蓖麻油性腹泻作用。吴志勇等[14]通过建立混合感染鸡的模型，筛选包含连翘等在内的6味中药对治疗混合感染鸡具有良好疗效。梁小瑞等[15]研究表明，连翘可提高ZO-1、Claudin-1和O-Cccludin的mRNA相对表达量，可在一定程度上促进有益菌群繁殖，抑制致病菌群生长，具有调节肠道菌群结构的作用。十堰地区野生连翘资源丰富。目前，对十堰地区连翘的研究多集中在种植、加工和连翘果实质量评价方面，对连翘叶的研究较少，将连翘叶作为禽畜饲料添加剂可以提高连翘非药用部位资源的有效利用率。本研究选取十堰地区野生连翘叶并对其有效成分进行提取，考察连翘提取物的体外抑菌和抗氧化活性，以期为十堰地区连翘叶开发成安全有效的功能性饲料添加剂提供参考。1材料与方法1.1试验仪器Thermo Utimate 3000高效液相色谱仪（美国赛默飞世尔）；色谱柱（waters C18 Column 4.6×250mm）、J/10002电子天平（上海衡平仪器仪表厂）、RE-52AA旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）、SHZ-DⅢ循环水真空泵（郑州市亚荣仪器有限公司）、KQ-250型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）、PTHW电热套（巩义市予华仪器有限责任公司）、ZNHW3000ML电热套（上海凌科实业发展有限公司）、标准药筛全套（东莞超凡筛网）、GR60DA立式自动压力蒸汽灭菌器（致微仪器有限公司）、DNP-9082BS-Ⅲ电热恒温培养箱（上海新苗医疗器械制造有限公司)、DGX-9243B-2干燥箱（上海福马实验设备有限公司）、HCB-1300V洁净工作台（青岛海尔生物医疗股份有限公司）、SHH.W21.三用电子恒温水箱（北京中兴伟业仪器有限公司）、UV-1900紫外可见分光光度计（岛津仪器（江苏）有限公司）。1.2试验试剂连翘酯苷A购自四川省维克奇生物科技有限公司，批号wkp18012210，纯度≥98%；连翘叶样品采自湖北省十堰市郧阳区大柳镇，经湖北医药学院教授张晓燕鉴定为木樨科连翘属植物连翘［Forsythia suspensa (Thunb.) Vahl］的叶子。大肠杆菌DH10B、金黄色葡萄球菌和白色葡萄球菌均由武当特色中药研究湖北省重点实验室提供；抗坏血酸购自天津欣泰怡科技有限公司，批号20200825；ABTS购自上海宝曼生物科技有限公司，批号202006纯度≥98%；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，l-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、邻二氮菲、硫酸亚铁、Tris，均购自上海麦克林生化科技有限公司；甲醇为色谱纯；水为超纯水；无水乙醇、30%双氧水等试剂均为国产分析纯。1.3测定指标及方法1.3.1连翘叶提取物的制备将采摘的新鲜连翘叶自然晾干，粉碎，过60目网筛。准确称取100 g连翘叶粉末，14倍水加热回流提取1 h，提取2次，趁热过滤，合并2次滤液。减压浓缩成浸膏，以连翘叶中主要成分连翘酯苷A含量为准，使用时配成不同浓度溶液。1.3.2色谱条件色谱柱为waters C18 Column (4.6 mm×250 mm)，流动相：A相为0.5%冰乙酸，B相为甲醇，梯度洗脱：0~10 min，30% B；10~23 min，30%~37% B；24~33 min，37%~45% B。进样量：5 μL，检测波长277、330 nm；流量：1 mL/min，柱温35 ℃。精密称取连翘酯苷A对照品20 mg，加甲醇定容于10 mL容量瓶中,超声溶解，补足减失重量，制成2 g/L标准品溶液，摇匀，低温保存。1.3.3　连翘叶提取物抗氧化活性试验1.3.4　DPPH·清除能力测定分别吸取质量浓度范围为0.25~5.00 mg/L的连翘叶水提取物样品各2.0 mL置于10 mL试管内，加入2.0 mL浓度为0.1 mmoL/L的DPPH无水乙醇溶液，振摇，混匀，室温避光反应30 min，于分光光度计517 nm处测定各自吸光度Ai，2.0 mL样品溶液混合2.0 mL无水乙醇溶液的吸光度A1。2.0 mL超纯水混合2.0 mL DPPH无水乙醇溶液的吸光度A0。以VC做阳性对照，VC质量浓度范围为0.25~5.00 mg/L，同法操作，每组试验重复3次，取平均值，计算连翘叶提取物对DPPH·清除率。DPPH·清除率=[1-(Ai-A1)/A0]×100%(1)以DPPH·清除率对样品浓度C（mg/L）作图，采用Origin75软件分析拟合方程，计算50％DPPH·清除率的样品浓度，即IC50值。DPPH·清除能力测定操作见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.019.T001表1DPPH·清除能力测定操作项目试管1（A0）试管2（A1）试管3（A样）空白管样品溶液02200.1 mmol/L DPPH醇溶液2020无水乙醇溶液0202超纯水2002mL1.3.5OH·清除能力的测定将连翘叶水提取物配成浓度为40~200 mg/L溶液作为样品。参照Fenton反应，取10 mL试管，分别加入1 mmol/L邻二氮菲无水乙醇溶液1 mL，0.2 mol/L磷酸盐缓冲液（pH值7.4）2.0 mL、超纯水1 mL、1 mmol/L FeSO4溶液1 mL，0.015% H2O2溶液1 mL，振摇，充分混匀，37 ℃水浴反应60 min，510 nm处测其吸光度值A0；使用1 mL超纯水代替H2O2，测吸光度值为A1；1 mL样品溶液替换1 mL超纯水，测得吸光度值为A样。1 mL样品溶液，2 mL磷酸盐缓冲液，3 mL超纯水510 nm处测得吸光度值为A参。取质量浓度为125~1 400 mg/L的VC做阳性对照，同法操作，每组试验重复3次，取平均值。计算OH·清除率。OH·清除率＝(A样-A0-A参)/(A1-A0)×100%(2)以OH·清除率对样品浓度C（mg/L）作图，采用Origin75软件分析拟合方程，计算在OH·清除率为50％时的样品浓度，即IC50值。OH·清除能力测定操作见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.019.T002表2OH·清除能力测定操作项目试管1（A0）试管2（A1）试管3（A样）试管4（A参）空白1 mmol/L邻二氮菲无水乙醇溶液11100磷酸盐缓冲液（pH值7.4）22224超纯水12032样品溶液001101 mmol/L FeSO4溶液111000.015% H2O2溶液10100mL1.3.6ABTS+·清除能力的测定将连翘叶提取物配制成浓度为1.25~60 mg/L的溶液作为待测样品。准确称取5 mg K2S2O4溶于10 mL 7 mmol/L的ABTS溶液中，室温避光放置16 h，使用甲醇稀释90倍得ABTS反应液。取10 mL试管，分别加入样品溶液0.2 mL和ABTS反应液5 mL，充分混匀，室温避光放置2 min，745 nm测得吸光值A样，0.2 mL超纯水替换0.2 mL样品溶液，测得吸光度值为A0，以VC做阳性对照，VC质量浓度范围为5~100 mg/L，同法操作，每组试验重复3次，取平均值。计算ABTS+·清除率。ABTS+·清除率＝(A0-A样)/A0×100%(3)以ABTS+·清除率对样品浓度C（mg/L）作图，采用Origin75软件分析得到拟合方程，计算在ABTS+·清除率为50％时的样品浓度，即IC50值。ABTS+·清除能力测定操作见表3。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.019.T003表3ABTS+·清除能力测定操作项目试管1(A0)试管2(A样)空白管ABTS反应液5.05.00样品溶液00.20甲醇005.2超纯水0.200mL1.4抑菌性试验1.4.1菌液的制备试验菌为金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌和大肠杆菌，吸取预先活化好的3种试验菌液各0.1 mL，分别置于15 mL灭菌的LB液体培养基中，充分混匀于37 ℃摇床内恒温振荡培养18 h，将菌悬液稀释20倍，稀释的金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌、大肠杆菌的OD值分别为0.3~0.32、0.25~0.27和0.19~0.21。1.4.2抑菌性试验的测定采用牛津杯法[16-17]进行抑菌性试验。将连翘叶提取液配制成不同浓度：0.4、0.8、1.2和1.6 g/L。吸取1.4.1所制的细菌稀释液，无菌涂布器均匀涂布于LB固体培养基平板上，静置5~10 min至表层菌液充分干燥，在上面等距离放置4个内径为6 mm灭菌牛津杯，使用无菌镊子轻轻按压，使其和涂菌培养基无缝贴合。在牛津杯内加入相应浓度的连翘叶提取液100 μL，超纯水做空白对照，将平板置于37 ℃培养箱16 h，观察抑菌情况。测量抑菌圈直径。以阿莫西林和头孢克肟为阳性对照，同法操作，每种药物和菌株做3次平行试验。抑菌敏感度判定结果参考周蓉等[18]的方法，抑菌敏感度判定见表4。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.019.T004表4抑菌敏感度判定项目抑菌圈直径01010~1415~2020敏感程度不敏感低度敏感中度敏感高度敏感极度敏感mm1.4.3最小抑菌浓度（MIC）的测定采用倍比稀释法[19]测定金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌和大肠杆菌的最低抑菌浓度（MIC）。将已知浓度的连翘叶提取液作为样品溶液。取标记为1~11号的11支试管，每支试管加入LB液体培养基2 mL，120 ℃高压灭菌20 min，1号试管中加入2 mL样品溶液，振摇混匀，吸取2 mL于2号试管内，再次混匀吸取2 mL于3号试管，依次倍比稀释至10号试管，从10号试管中吸取2 mL弃掉，11号试管加入2 mL无菌生理盐水作为对照。在每支试管内加入0.1 mL细菌悬液，混匀，37 ℃摇床内恒温振荡培养12 h。试管内透明澄清，无明显浑浊和沉淀的样品浓度即为能抑制该细菌生长的MIC。2结果与分析2.1连翘叶提取物的抗氧化活性2.1.1连翘叶提取物和VC对DPPH·清除率的对比结果（见图1）由图1可知，连翘叶提取物的DPPH·清除率随浓度的增加而提高，浓度为2.0 mg/L时，DPPH·的清除率为70.30%；VC浓度为4.5~7.5 mg/L时，DPPH·清除率增长较快，浓度为10.5 mg/L时，DPPH·清除率为79.73%。在达到饱和点后DPPH·的清除率均不再随着连翘叶水提取物和VC浓度的增加而上升，两者对DPPH·的IC50值分别为1.29和6.23 mg/L，VC提取物在达到饱和点时的DPPH·清除率比连翘叶水提取物高9.43%，但IC50值却是连翘叶水提物的4.8倍。因此，连翘叶提取物具有一定的抗氧化活性，且清除DPPH·的能力高于VC。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.019.F001图1连翘叶提取物和VC对DPPH·清除率的对比结果2.1.2连翘叶提取物和VC对OH·的清除率的对比结果（见图2）由图2可知，不同浓度的OH·清除剂对OH·的清除能力不同。连翘叶水提物对OH·的清除率曲线基本呈良好的线性增长。浓度为200 mg/L时，连翘叶水提物的OH·清除率可达96.98%；相同浓度下，阳性对照VC对OH·的清除率仅为33.32%。在检测浓度范围内VC对OH·清除率随着浓度的增加缓慢增长。在浓度为1 400 mg/L时，OH·的清除率为88.23%，连翘叶提取物和VC的IC50值分别为100.71和388.19 mg/L。因此，相同浓度的连翘叶提取物对OH·的清除力优于VC。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.019.F002图2连翘叶提取物和VC对OH·的清除率的对比结果2.1.3连翘叶提取物和VC对ABTS+·的清除率的对比结果（见图3）由图3可知，连翘叶水提物和VC对ABTS+·清除率与浓度呈正相关，在测定浓度的最大值（连翘叶提取物为60 mg/L，VC为100 mg/L）均可使ABTS+·完全清除，即ABTS+·清除率可达到100%。浓度相同时，连翘叶提取物对ABTS+·清除率高于VC。连翘叶提取物和VC对ABTS+·的IC50值分别为16.30、47.70 mg/L。因此，说明连翘叶水提物具有比VC更好的ABTS+·清除能力。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.019.F003图3连翘叶提取物和VC对ABTS+·的清除率的对比结果2.2连翘叶提取物对试验菌的抑菌活性2.2.1连翘叶提取物的体外抑菌效果（见图4、图5、表4、表5）10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.019.T005表4不同浓度连翘叶提取物对试验菌的抑菌圈直径项目金黄色葡萄球菌白色葡萄球菌大肠杆菌1.6 g/L13.7±0.619.0±0.112.4±0.61.2 g/L11.9±0.817.0±0.211.6±0.40.8 g/L10.5±0.915.7±0.310.0±0.20.4 g/L9.0±0.213.6±0.69.0±0.1mm由图4可知，连翘叶提取物对金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌圈，边缘较为整齐圆整，圈内透明。抑菌圈直径可以衡量抑菌效果。连翘叶提取物浓度越高，抑菌圈越大，抑菌效果越明显，抑菌效果和浓度呈正相关。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.019.F004图4不同浓度连翘叶提取物对3种试验菌的抑菌活性注：A、B、C、D、E分别为0.4、0.8、1.2、1.6 g/L连翘叶提取物和超纯水。由表4可知，0.4 g/L的连翘叶水提物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌圈均值为9.0 mm，属于低度敏感，对白色葡萄球菌的抑菌圈均值为13.6 mm，属于中度敏感；连翘叶水提物浓度在0.8~1.6 g/L时，对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌圈均值在中度敏感范围内（10~14 mm），且对金黄色葡萄球菌的抑菌圈均略高于大肠杆菌，而对白色葡萄球菌的抑菌圈均值则可达到高度敏感范围（15~20 mm）。因此，相同浓度的连翘叶水提物对白色葡萄球菌的抑制效果最为明显，其次是金黄色葡萄球菌，对大肠杆菌的抑制能力稍弱。由表5、图5可知，阳性对照品对3种试验菌有较强的抑菌活性。对比表4和表5可知，相同浓度的阳性对照品对3种试验菌产生的抑菌圈均大于连翘叶提取物，且产生和连翘叶提取物相当的抑菌效果的浓度各不相同，阳性对照品对3种试验菌的抑菌圈大小为：大肠杆菌金黄色葡萄球菌白色葡萄球菌。阿莫西林和头孢克肟是兽医在畜禽养殖方面的常用药，随着相关动物饲用产品禁抗政策的出台已被禁止使用，与阿莫西林和头孢克肟对比结果显示，连翘叶水提物的抑菌效果弱于阳性对照，但是在所测定浓度下其产生的抑菌效果也已达到中度敏感甚至高度敏感，因此，连翘叶水提取物具有较好的抑菌性能。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.019.T006表5不同浓度阳性对照品对试验菌的抑菌圈直径项目金黄色葡萄球菌白色葡萄球菌大肠杆菌头孢克肟阿莫西林头孢克肟阿莫西林头孢克肟阿莫西林1.600 00 g/L26.8±1.24022.3±1.419.4±0.527.3±1.224.7±0.31.200 00 g/L24.3±1.74021.4±2.618.2±1.025.0±0.123.6±0.30.800 00 g/L23.0±1.14019.6±2.016.2±0.823.3±0.420.8±0.60.400 00 g/L19.6±1.43617.4±1.213.1±0.320.0±0.618.5±0.40.200 00 g/L17.0±0.83615.2±0.610.4±0.419.0±0.816.4±0.50.100 00 g/L14.0±0.53613.0±1.38.3±0.518.4±1.114.3±0.70.050 00 g/L10.0±0.73610.0±0.9—17.2±0.511.4±0.60.025 00 g/L8.0±0.335——16.4±0.39.5±0.50.012 50 g/L—28——15.6±0.2—0.006 25 g/L—21——15.0±0.9—0.003 00 g/L—18——12.3±0.3—0.001 50 g/L—15——9.7±1.7—注：“—”表示无明显的抑菌圈。mm10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.019.F005图5不同浓度阿莫西林和头孢克肟对3种试验菌的抑菌活性注：A、B、C、D分别为0.4、0.8、1.2、1.6 g/L阿莫西林和头孢克肟。2.2.2连翘叶提取物对试验菌MIC的影响（见表6）按“1.4.3”项方法测定连翘叶水提物对金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌和大肠杆菌的MIC。在实际操作中肉眼不易区分MIC附近的几个试管中是否有菌体生长，因此，从试管中各取0.1 mL培养液接种于LB固体培养基，37 ℃培养12 h观察有无菌落生长。由表6可知，金黄色葡萄球菌和白色葡萄球菌的MIC为0.100 g/L，大肠杆菌的MIC为0.200 g/L，连翘叶水提物对金黄色葡萄球菌和白色葡萄球菌的抑菌效果略强于大肠杆菌，与牛津杯法测定的抑菌性能的结果相似。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.019.T007表6连翘叶提取物对试验菌MIC的影响MIC金黄色葡萄球菌白色葡萄球菌大肠杆菌0.800 g/L---0.400 g/L---0.200 g/L---0.100 g/L--+0.050 g/L++++0.025 g/L+++++++注：“-”表示无菌落生长，“+”表示有少量菌落生长，“++”表示有较多菌落生长，“+++”表示菌落生长较旺盛。3讨论本试验采用天然植株提取物抗氧化活性常用的DPPH·、OH·和ABTS+·方法[20]，以清除率IC50值为指标评价连翘叶水提取物的抗氧化活性，并以VC为阳性对照。3种抗氧化活性试验的反应体系和试验原理各不相同，对被测物质的抗氧化活性的评价有所差异，但试验结果具有一致性，即同等浓度时连翘叶水提物具有更高的DPPH·、OH·和ABTS+·的清除力，且在达到相同清除率时，连翘叶水提物的IC50值更小，表明连翘叶水提物的抗氧化活性优于VC，具有较强的抗氧化性能，对降低动物氧化损伤具有重要意义。抑菌活性试验显示，连翘叶水提物对金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌和大肠杆菌均有一定的抑菌性能，抑菌能力大小为：白色葡萄球菌金黄色葡萄球菌大肠杆菌。连翘叶水提物对金黄色葡萄球菌和白色葡萄球菌的MIC为0.1 g/L，大肠杆菌的MIC为0.2 g/L，即连翘叶水提物对供试的革兰氏阳性（G+）细菌（金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌）的抑菌能力强于对革兰氏阴性（G-）细菌（大肠杆菌）的抑菌能力。与阳性对照药物相比，其抑菌能力总体上弱于阿莫西林和头孢克肟，但是可通过对连翘叶水提物进行浓度的调整以达到特定的抑菌效果，因此，连翘叶在天然植物抗生素的开发方面具有较大的潜力。4结论十堰地区连翘叶水的提取物具有较好的抗氧化功能和抑菌活性，对动物生长过程中的抗氧化、消除多余自由基等作用效果比抗生素的效果好，可以为后续畜牧抗生素替代的研究提供参考。