精液中细菌数量是衡量牛冷冻精液质量的一项重要指标。我国牛冷冻精液国家标准规定，每剂量精液中细菌数不得超过800个[1]。为达这一标准，必须严格把握采精环节。精液中产生细菌的主要原因为公牛生殖器官疾病，也与采精、冻精生产过程有关。公牛包皮内含大量肠球菌、葡萄球菌、大肠杆菌等，是公牛精液中细菌的主要来源[2]。精液中细菌数过多，不仅可造成精子活力降低、生存时间缩短，并且极易造成胚胎早期死亡，甚至引发母牛繁殖障碍[3]。采精时对公牛阴茎包皮的清洗至关重要[4]，若采精前冲洗包皮，可在一定程度上防止细菌污染[5]。但也有研究显示，采精前不必为每头公牛冲洗包皮，清洗不当更可能传播疾病[6]。因此，本研究在冬春两季开展采精前冲洗包皮对精液内细菌数量变化影响的对比试验，以期为种公牛站精液生产提供参考。1材料与方法1.1试验动物采精公牛来自辽宁省牧经种牛繁育中心有限公司。1.2试剂与仪器仪器：BCX－200包皮冲洗装置，购自日本富士平工业株式会社；IS4型细管灌封喷码一体机、ACCUCELL精液密度测定仪、TMS-160MHS细管精液冷冻仪，均购自法国IMV公司；DHP-9162恒温培养箱，购自北京永光明医疗器械厂；SW-CJ-1D超净化工作台，购自苏州净化仪器厂；DZKW-D-5-6恒温水浴箱，购自北京永光明医疗器械厂；YP-B2002天平，购自江苏省常州万得天平仪器厂；LDZX－30KBS电热压力蒸气灭菌器，购自上海申安医疗器械厂；细管剪，购自法国IMV公司。0.25 mL细管、细管专用推针（自制）、平皿（直径90 mm）、酒精灯、记号笔等。试剂：Bioxcell稀释液（法国IMV公司）、02-75营养琼脂培养基（北京奥博星生物科技有限责任公司）、75%酒精。1.3试验方法1.3.1试验时间选择冬季（2020年12月—2021年2月）、春季（2021年4月—6月）进行。试验期共6个月。1.3.2试验设计14头种公牛，分对照组和试验组，每组选择7头采精公牛。冬春两季各开展1次试验，每次试验每头公牛重复检测3次，即每月进行1次检测。对照组公牛采精前采用包皮冲洗机，约38 ℃温水冲洗包皮及阴毛周围污物，停留20 min，水滴淋干后进行采精；试验组公牛采精前不冲洗包皮，牵入采精场直接采精。1.3.3冻精生产冻精按照DB21/T 3006—2018进行[7]。精液采集后分别对其活力、密度、采精量进行检查；根据精液的活力、密度、每剂量有效精子数稀释精液，常温下灌装，封口，4~5 ℃低温柜中降温、平衡3~4 h，低温柜中码帘上架，全自动冷冻仪中冷冻。冷冻完成后，每头牛抽取2支细管冻精进行检测。1.3.4细菌检测超净化工作台内点燃酒精灯，平皿标记样品编号。细管冻精37 ℃水浴解冻，酒精棉球擦拭整支细管，剪掉超声波封口端，细管推针将整支细管的精液（0.18~0.20 mL）注入平皿；注入10~15 mL保温至46~50 ℃的营养琼脂培养基至平皿，转动平皿使其与精液混合均匀，并做一空白对照。琼脂凝固后翻转平板，（36±1）℃培养（48±2）h，平皿内菌落数计数法参考国家标准（GB 4143—2008）。B=(n1+n2+n3)/3（1）式中：B为细菌数；n1为第一次试验样品中细菌数；n2为第二次试验样品中细菌数；n3为第三次试验样品中细菌数。1.4数据统计与分析数据采用Excel进行初步处理，采用GraphPad Prism 5软件进行统计学分析，组内差异采用单因素方差分析（One-way ANOVA），组间差异采用独立样本t测验比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1冬季采集精液中细菌数量变化（见表1）由表1可知，对照组细菌数量为1.7~10.3个/支，组内个体间细菌数量差异显著；样本2、6细菌数量显著高于其他组（P0.05）。试验组细菌数量为2.0~12.7个/支，组内个体间细菌数量差异显著；样本4的细菌数量显著高于其他组（P0.05）。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.02.005.T001表1冬季采集精液中细菌数量变化Tab.1Changes in the number of bacteria in semen collected in winter组别样本1样本2样本3样本4样本5样本6样本7对照组2.3±1.9b8.0±7.0a1.7±1.7b6.7±3.2b5.0±7.0b10.3±6.7a6.0±5.0b试验组2.0±1.5b7.0±5.1b5.3±3.2b12.7±9.4a7.0±7.0b3.7±2.7b6.3±4.9b注 ：同行数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。个/支试验结果表明，公牛冲洗包皮与否，组内个体间细菌数量均存在较大差异。2.2春季采集精液中细菌数量变化（见表2）由表2可知，对照组细菌数量为0.3~3.3个/支，组内个体间细菌数量差异不显著（P0.05）。试验组细菌数量为2.0~8.3个/支，组内个体间细菌数量差异显著（P0.05）；样本1、3细菌数量显著低于其他组（P0.05）。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.02.005.T002表2春季采集精液中细菌数量变化Tab.2Changes in the number of bacteria in semen collected in spring组别样本1样本2样本3样本4样本5样本6样本7对照组0.3±0.33.0±2.11.7±1.73.3±1.91.3±1.33.0±2.52.0±2.0试验组2.7±2.2b6.3±5.4a2.0±1.5b7.3±3.8a8.3±6.4a6.3±3.3a6.0±5.0a个/支2.3不同季节种公牛包皮冲洗与否对精液中细菌数量的影响（见表3）由表3可知，不同季节采精，对照组与试验组细菌数量均无显著差异（P0.05）。试验组平均细菌数量大于对照组，即不冲洗包皮采集精液中细菌数量多于冲洗包皮，但两组的细菌数量均低于国家标准要求。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.02.005.T003表3不同季节种公牛包皮冲洗与否对精液中细菌数量的影响Tab.3Influence of washing foreskin of bulls in different seasons on the number of bacteria in semen组别春季冬季对照组2.6±0.65.5±1.5试验组5.2±1.37.6±9.3个/支3讨论公牛包皮内含大量细菌，采精时对公牛包皮冲洗与否可影响细菌的混入程度。本试验结果表明，种公牛采精前包皮冲洗与否对精液中细菌数量无显著影响，与康年登等[8]、郝爱玲等[9]研究结果不一致。组内个体间差异极显著，但同一头牛不同批次间差异不大，原因可能是不同的牛其包皮、阴筒、牛体卫生等条件不同，而同一头牛不同批次间在正常情况下其卫生条件是相对稳定的，此结果与陆汉希[10]研究结论一致。试验组与对照组比较无显著差异，说明公牛包皮内卫生环境相对稳定，与包皮是否冲洗无显著影响。公牛冲洗包皮与否，应根据气候环境、牛体卫生、个体健康等情况考虑[11]。在气候适宜的春、秋季节（夏季炎热季节停采），公牛主要在室外活动，在保证环境卫生和牛体卫生的情况下，不必冲洗所有公牛包皮；在气候寒冷的冬季，公牛大部分时间在舍内饲养，通风条件差，空气湿度大、有害气多，牛体卫生不便清洁，包皮和阴毛附着粪尿易滋生细菌，此时对公牛包皮的清洗至关重要。自然交配时细菌可在公牛和母牛之间传播，人工采集精液也不可能完全避免细菌污染。国家要求每头牛每季度至少做一次冻精质量检测，细菌数是主要检查项目之一。通过冻精质量检测报告，可动态监测精液中细菌数变化情况；精液中细菌数量显著增多、接近800个时，应考虑冲洗公牛包皮。辽宁省牧经种牛繁育中心日常检测结果中，2/3的样品细菌数为0，可能与稀释液中加入过多抗生素有关；极个别样品中细菌数超过800个/支，原因为采精过程中公牛阴茎触及不洁台牛后躯，与公牛是否冲洗包皮无关。除非存在特别污染问题，一般情况下不必对所有精液样品作细菌培养，每隔4~6个月随机抽取20~30个精液样品作细菌检查是适宜的做法，不仅保证精液质量，还能够发现公牛是否患病，改进采精技术，改善卫生条件。公牛卫生状况好，精液污染的风险也随之降低。因此，应保持日常的环境与牛体卫生。牛舍保持清洁干燥；坚持每天刷拭牛体，夏季结合水刷，冬季干刷。定期修剪公牛阴毛，长度以1.5~2.0 cm为宜。若部分公牛包皮容易藏垢，则每次采精时必须冲洗干净。采精前保持采精场所卫生，地面洒水降尘，清洁公牛和台牛体表的浮尘、污物，尤其对公牛下腹部、台牛臀部进行清洗，刷刨，达到全身被毛无污染、无灰土，保证牛群处于最佳采精的状态。为需要冲洗包皮种公牛冲洗时，喷嘴不应直接接触阴毛和包皮，更不可将喷嘴伸入包皮内，引起公牛包皮炎症。无冲洗条件或清洗达不到要求的养殖场，则不提倡冲洗包皮；若冲洗不干净反而会破坏包皮屏障功效，造成污染[12]。4结论试验仅对公牛一个月内不冲洗包皮采集的精液中细菌数变化进行研究，但更长时间的情况还需进一步试验验证。本次试验选择14头公牛，检验样本84头份，精液中所含细菌数均远低于国家标准要求的800个/支。试验结果表明，在保证环境卫生和牛体卫生的条件下，种公牛采精前冲洗包皮与否对精液中细菌数无显著影响。除非特殊需要，采精前不必为每头公牛冲洗包皮，操作不当可能增加传播疾病的风险。