猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea，PED）是目前对猪群危害最严重的消化道疾病之一，由猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）感染引起，以哺乳仔猪的急性腹泻、呕吐、严重脱水为主要临床症状，病死率可达50%~100%[1-3]。猪流行性腹泻在国内的流行形势依然严峻，如何更好地防控PED，降本增效，对猪场的经济收益具有重要影响。养殖场为防控PEDV，采用了不同方案，如增加疫苗的免疫频次和剂量、返饲[4]、采用不同免疫方式：活疫苗＋活疫苗[5]、活疫苗＋灭活疫苗[6]、灭活疫苗＋灭活疫苗[7-8]。从科研和应用角度考虑，尚无公认的可行方法和标准。今年4~5月，新疆一规模场暴发腹泻。产房3~7 d仔猪出现严重水样腹泻，腹泻仔猪很快表现消瘦、脱水和死亡，病死率20%~30%。采集粪便拭子和死亡仔猪小肠组织，进行猪腹泻病原的检测和测序，病原鉴定结果为PEDV。S基因测序结果显示，此毒株JMSE-PEDV-20210506与灭活疫苗XJ-DB株核苷酸相似性最高，为97.6%；与经典疫苗株CV777核苷酸相似性为93.4%。因此，本研究采用与临床毒株同源性相近的XJ-DB株及2针灭活疫苗方式进行紧急免疫，并对其免疫效果进行抗体检测和效力评估，以期为猪流行性腹泻的防控提供参考。1材料与方法1.1试验材料猪流行性腹泻灭活疫苗（XJ-DB），由天康生物制药有限公司技术中心制备提供。抗体检测试剂盒：PEDV-IgA抗体检测试剂盒（IDEXX公司）、PEDV-IgG抗体检测试剂盒（宝威特生物公司）；病原检测试剂盒：猪流行性腹泻病毒实时荧光RT-PCR检测试剂盒（北京世纪元亨动物防疫有限公司）。1.2试验动物健康妊娠母猪500头，由某规模化场提供。1.3试验方法1.3.1免疫程序颈部肌肉免：疫妊娠母猪4 mL/头，产前30 d进行1次免疫，产前15 d进行1次加强免疫。1.3.2测定指标及方法采集免疫前、一免后15 d、二免后15 d的血清及初乳各30份，检测PEDV中和抗体及免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白G（IgG）特异性抗体，并统计分析其阳性率、平均值和离散度。采集30份免疫后肛拭子进行PEDV病原检测。检测方法均按照实际和说明书执行。2结果与分析2.1血清PEDV IgG特异性抗体检测结果（见图1）由图1（a）可知，妊娠母猪免疫前IgG特异性抗体阳性率为80%，一免后15 d提升至100%；离散度由免疫前69%降至33%。由图1（b）可知，免疫前特异性抗体平均值为0.62，一免后提升为1.65，二免后可提升至2.36（血清IgG特异性抗体检测判断标准：≥0.5为阳性）。图1血清PEDV IgG特异性抗体检测结果Fig.1Test results of PEDV IgG specific antibody in serumXX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.01.010.F1a1XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.01.010.F1a2结果表明，灭活疫苗免疫后2 w，血清中的IgG特异性抗体水平明显升高。2.2血清PEDV IgA特异性抗体检测结果（见图2）由图2（a）可知，妊娠母猪免疫后IgA特异性抗体阳性率，免疫前即为100%；离散度由免疫前41%，下降至二免后的5%。由图2（b）可知，免疫前抗体平均值达2.52，一免后15 d，平均值上升至5.48；二免后略有下降，为4.16。图2血清PEDV IgA特异性抗体检测结果Fig.2Test results of PEDV IgA specific antibody in serumXX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.01.010.F2a1XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.01.010.F2a2结果表明，免疫前IgA特异性抗体的阳性率和平均值均处于较高水平，但灭活疫苗免疫，可再次大幅提升IgA特异性抗体水平。2.3血清PEDV中和抗体检测结果（见图3）由图3可知，妊娠母猪免疫前中和抗体水平为1∶22，一免后平均值达1∶280，二免后的平均值达到1∶256，二免后个别猪中和抗体可达1∶512，甚至1∶1 024。结果显示，灭活疫苗免疫可刺激机体产生有效的中和抗体。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.01.010.F003图3血清PEDV中和抗体检测结果Fig.3Test results of PEDV neutralizing antibody in serum2.4初乳PEDV IgG、IgA特异性抗体的检测结果（见图4）由图4（a）可知，初乳IgG、IgA特异性抗体阳性率均为100%，离散度分别为27%、4%。由图4（b）可知，初乳IgG、IgA特异性抗体平均值分别为2.76和4.12。以上结果与二免后血清中的IgG、IgA特异性抗体结果一致。结果表明，初乳特异性抗体水平高，可预期仔猪能够获得有效的被动免疫保护。图4初乳PEDV IgG、IgA特异性抗体的检测结果Fig.4Test results of PEDV IgG, IgA specific antibody in colostrumXX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.01.010.F4a1XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.01.010.F4a22.5免疫后排毒检测结果（见表1）由表1可知，临床上未观察到各窝仔猪出现流行性腹泻的特征症状。仔猪腹泻情况有明显好转。临床收集的30份肛拭子样品，腹泻病原排毒检测结果均为阴性，未检测到母猪排毒。阴性及阳性对照品均测得对应检测结果，表示试验结果成立。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.01.010.T001表1免疫后排毒检测结果Tab.1Fecal swab viral RNA levels determined by RT-qPCR编号Ct值结果编号Ct值结果阴性对照ND-阳性对照19.04+1ND-16ND-2ND-17ND-3ND-18ND-4ND-19ND-5ND-20ND-6ND-21ND-7ND-22ND-8ND-23ND-9ND-24ND-10ND-25ND-11ND-26ND-12ND-27ND-13ND-28ND-14ND-29ND-15ND-30ND-注 ：ND表示无曲线、无Ct值；“-”表示阴性；“+”表示阳性。3讨论3.1免疫灭活疫苗对仔猪的保护效力在妊娠母猪感染场，免疫灭活疫苗第15 d的血清中，中和抗体水平明显提升，产生了高水平且稳定的IgG、IgA特异性抗体。乳猪通过初乳获得大量的抗体，产生有效的被动免疫保护。本试验同时检测了初乳中IgG、IgA特异性抗体，评价初乳中的抗体水平。分娩当日的初乳中检出大量IgG和IgA特异性抗体；观察产后的仔猪未见腹泻临床症状，表明腹泻得到有效控制，仔猪获得了良好的被动保护效力。结果表明，在猪流行性腹泻感染场，妊娠母猪产前免疫2针灭活疫苗的免疫方案，可紧急免疫防控猪流行性腹泻。3.2灭活疫苗的选择目前市场上有多种活疫苗和灭活疫苗可供选择。多数猪场为预防PEDV，选择妊娠母猪产前进行活苗＋灭活苗免疫2~3次，或采用灭活苗2~3次的免疫方案；还有一些猪场，选择活苗和灭活苗同时免疫的方案。各场选择疫苗和免疫方案的标准不一[9-11]。本研究根据测序结果，选择与流行毒株序列同源性为97.6%的灭活疫苗，采用灭活疫苗＋灭活疫苗的免疫方式，按照分娩前4 w和2 w各免疫1次的免疫程序进行免疫。结果显示，母猪体内产生高水平且稳定的中和抗体和IgG、IgA特异性抗体，临床达到预期的使用效果，表明选择灭活疫苗同源性97%以上的疫苗是有效的。3.3新疆猪场流行性腹泻流行情况本猪场爆发流行性腹泻，发病率30%~50%，病死率20%~30%，造成严重损失。采集粪便拭子和死亡仔猪小肠组织进行病原检测和测序分析，确定病原为PEDV，将S基因序列进行遗传进化分析，显示毒株JMSE-PEDV-20210506属GⅡA亚型，与近期国内分离鉴定的PEDV流行毒株多为GⅡA亚型的情况相符[13]。3.4中和抗体和ELISA抗体的关系预防PEDV等肠道病毒感染过程中，肠道中的中和抗体起重要作用。Jang等[12]评估了1种PEDV灭活疫苗对已自然感染过PEDV的母猪分泌的常乳和初乳中的中和抗体水平的影响，结果表明，灭活疫苗可提高已感染母猪的乳汁和初乳中的中和抗体水平和PEDV IgA、IgG特异性抗体水平。PEDV灭活疫苗通过增加肠道部位乳源中和抗体的传递提高感染母猪的仔猪对PEDV感染的保护力[13]。本试验中，母猪血清中抗体水平提高，促使初乳中产生足量可供保护仔猪的中和抗体，与上述研究结果一致。本试验中，灭活疫苗免疫后，妊娠母猪的血清及初乳均产生了大量的有效的中和抗体和IgG、IgA的特异性抗体；虽然中和抗体和ELISA抗体并不呈线性关系，但存在一定的正相关关系。在临床检测方面，中和抗体检测对于大多数猪场均比较困难。因此，ELISA抗体的检测可为猪场PEDV抗体的检测提供一定参考价值。3.5PEDV感染的季节性变化近年来的临床发病情况显示，PEDV已不再呈现明显的季节性，四季皆可发病[14]，腹泻防控更为困难。此规模猪场同样呈现此种趋势，除了做好PEDV的普免和跟胎免疫，更应坚持PEDV环境样品监测和日常消毒管理措施的严格落地实施[15-17]。4结论本研究结果表明，猪流行性腹泻病毒的感染场，采用妊娠母猪产前2针灭活疫苗的免疫程序，母猪免疫后的血清和初乳中可产生高水平且稳定的中和抗体和IgG、IgA特异性抗体，可有效保护仔猪。灭活疫苗可应用于猪流行性腹泻感染场的紧急免疫防控。