栖息在反刍动物瘤胃内的细菌、真菌、原虫及古菌等微生物相互协同，可以将饲粮中植物纤维资源降解成被宿主利用的能量物质。1977年，Orpin[1]首次从绵羊瘤胃中分离出厌氧真菌，对瘤胃真菌的研究逐渐成为热点。瘤胃真菌（103~104个/mL）均为严格厌氧，最适宜生长的pH值为6.5~6.8，温度为33~41℃。虽然瘤胃真菌只占整个瘤胃微生物的5%~20％，但在瘤胃中发挥着重要功能。John等[2]发现，瘤胃真菌可降解蛋白质和淀粉。对植物纤维降解的能力超过整个细菌。真菌降解纤维素可分为穿透牧草角质层的物理性降解和分泌纤维素降解酶的化学性降解。瘤胃真菌与其他微生物之间存在协同和抑制等作用，如与产甲烷菌共同培养可提高植物降解酶的活力，与产甲烷古细菌联系密切，其活性增强能够促进甲烷排放[3]。内蒙古绒山羊主要产于内蒙古西部地区，长期以放牧为主，具有耐粗饲、适应性强、绒质好、经济价值可观的特性。其产地牧草粗纤维含量高，部分放牧地以玉米秸秆为主。随着划区轮牧和草畜平衡制度执行力度的加大，一方面需要提高绒山羊的饲料转化效率；另一方面需要推动绿色健康养殖模式的发展，以减少甲烷等温室气体的排放。对绒山羊瘤胃微生物区系结构和功能进行有效调控是实现该目标的核心。近年来，对瘤胃真菌及其多样性的报道较为少见。因此，本研究采用不同类型日粮饲喂内蒙古绒山羊，研究日粮结构对其瘤胃真菌多样性的影响，以期达到提高绒山羊饲料利用效率、探究甲烷减排的机制的目的。1材料与方法1.1试验动物及饲养管理选择24只体况良好、体重约25 kg、8月龄内蒙古大青山绒山羊母羊，随机分为4组，每组6只。经驱虫后，预试期前饲养观察7 d。各组日粮分别为苜蓿（G1）、苜蓿补饲精料（G2）、玉米秸秆（G3）、玉米秸秆补饲精料（G4）。每天8：00和17：00饲喂2次，补饲组的补饲时间均为17：00。玉米秸秆及苜蓿青干草均产自当地。精料为大北农饲料产业提供的981号饲料与玉米粒的混合料。每天每只山羊补饲量200 g，饲粮精粗比为25∶75。自由饮水，其他饲养条件相同。预试期10 d，正式试验期30 d。每天记录每只羊体重的变化及日采食量。日粮组成及营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.002.T001表1日粮组成及营养水平（干物质基础）项目G1组G2组G3组G4组原料组成/%苜蓿青干草1007500玉米秸秆0010075精料025025合计100100100100营养水平总能/(MJ/kg)17.3017.1016.5016.50干物质/%95.5094.5094.4093.70粗蛋白/%13.9513.334.526.26粗脂肪/%4.043.943.353.43中性洗涤纤维/%57.7646.5971.3256.76酸性洗涤纤维/%41.1131.9542.9233.31钙/%0.620.570.520.50磷/%0.160.210.050.12注：1.精料中含粗蛋白15.14%、粗脂肪3.81%、中性洗涤纤维16.29%、酸性洗涤纤维5.82%、钙0.82%、磷0.42%、食盐0.30%~2.00%。2.营养水平均为实测值。1.2瘤胃液采集瘤胃液的采集在正式试验期第30 d进行，采集前空腹12 h。将连接金属探头的PVC管从试验羊的口部插入瘤胃，使用真空泵抽取瘤胃液。每只羊分别采集瘤胃液50 mL，使用4层纱布过滤，取少量滤液分装于5个2.0 mL的冻存管中，先存放于液氮中，回实验室后放入-80 ℃冰箱保存，用于分子试验。1.3瘤胃真菌多样性的测定本试验以DNA为模板，对ITS1区进行扩增，DNA的提取方法参考文献[4]。PCR引物序列为F：GGTGGTGTMGGATTCACACARTAYGCWACAGC；R：TTCATTGCRTAGTTWGGRTAGTT，扩增条件为95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s→55 ℃退火30 s→72 ℃变性45 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR反应体系20 μL，包括10 ng DNA模板、0.8 μL上游引物、0.8 μL下游引物、4 μL 5×Fastpfu Buffer、2 μL 2.5 mmol/L dNTPs、0.4 μL Fastpfu Polymerase、0.2 μL BSA，补ddH2O至20 μL。使用2%琼脂糖凝胶电泳，上样3 μL进行检测，结果为条带正确，浓度合适，可进行后续PCR产物纯化。2结果与分析2.1内蒙古绒山羊瘤胃真菌测序样本量经 Illumina MiSeq高通量测序，试验共得996 552条真菌有效基因序列，各样品有效序列个数为41 523。绒山羊真菌的Pan和Core曲线见图1。由图1可知，随样本量增加，Pan曲线没有趋于平缓，说明随样本增加，总OTU仍有增加趋势；Core曲线趋于平缓，说明随着样本量的增加，核心物种出现的速率逐步降低。图1绒山羊真菌的Pan和Core曲线10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.002.F1a1（a）Pan曲线10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.002.F1a2（b）Core曲线真菌样本稀释曲线见图2。由图2可知，Sobs指数和Shannon指数的稀释曲线均趋于平缓，说明本试验测序数据量能够覆盖每组样品的多数微生物。图2真菌样品稀释曲线10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.002.F2a1（a）Sobs指数10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.002.F2a2（b）Shannon指数2.2绒山羊瘤胃真菌OTU聚类分析及α多样性分析不同日粮组绒山羊瘤胃真菌OTU Veen图见图3。由图3可知，4组真菌共有639个OTU，G1、G2、G3和G4组的OTU个数分别为392、345、351和352。每组均有的OTU为152个，每组特有的OTU为G1组87个、G2组81个、G3组36个、G4组37个。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.002.F003图3不同日粮组绒山羊瘤胃真菌OTU Veen图真菌Alpha多样性指数见表2。由表2可知，Shannon指数由小到大为G4组G3组G1组G2组；Simpson指数表现为G1组、G2组G3组G4组，各组间均无显著差异（P0.05）；Ace、Chaol指数由低到高为G1组G2组G3组G4组，G1组显著低于其他组（P0.05）。各组覆盖率均高于99.98%，说明本试验能够覆盖每个样品多数微生物，可以较好地反映真菌多样性。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.002.T002表2真菌Alpha多样性指数项目G1组（苜蓿）G2组（苜蓿补饲精料）G3组（玉米秸秆）G4组（玉米秸秆补饲精料）P值Shannon指数3.290±0.1503.360±0.1503.050±0.2802.810±0.1400.182Simpson指数0.085±0.0120.085±0.0150.158±0.0650.171±0.0230.205Ace指数141.860±8.000b188.580±15.570a193.320±5.210a215.510±6.640a0.001Chao指数141.030±7.830b189.000±15.780a194.730±5.300a215.990±5.940a0.001覆盖率/%99.990±0.00099.990±0.00099.980±0.00099.980±0.0000.014注：同行数据肩标不同小写字母表示差异显著（P0.05），相同字母或者无字母表示差异不显著（P0.05），下表同。2.3PCoA聚类分析真菌β多样性PCoA分析见图4，图中样本点的空间距离代表样本间的距离。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.002.F004图4真菌β多样性PCoA分析由图4可知，G1组与G2组间、G3组与G4组组间差异不大；G1、G2组与G3、G4组组间的组间差异较大；G2组与G3组组间差异性最大。2.4日粮类型对绒山羊瘤胃真菌区系及菌群丰度的影响本试验中，4组共24只绒山羊瘤胃液中的真菌共有8个门、23个纲、53个目、121个科、209个属、318个种。2.4.1日粮类型对绒山羊瘤胃真菌门水平物种组成的影响（见表3）由表3可知，优势菌门为子囊菌门，G1组、G2组、G3组、G4组分别为61.89%、50.99%、73.85%、78.97%，G2组显著低于G3组、G4组（P0.05）。G1组、G2组次级优势菌门为新丽鞭毛菌门，G3组、G4组次级优势菌门为担子菌门。除子囊菌门外，其他菌门各组间差异均不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.002.T003表3日粮类型对绒山羊瘤胃真菌门水平物种组成的影响项目G1组（苜蓿）G2组（苜蓿补饲精料）G3组（玉米秸秆）G4组（玉米秸秆补饲精料）P值子囊菌门（Ascomycota）61.89±5.51ab50.99±8.53b73.85±5.32a78.97±3.88a0.017新丽鞭毛菌门（Neocallimastigomycota）19.76±4.6427.34±9.629.25±4.096.61±1.350.068担子菌门（Basidiomycota）15.22±2.6518.69±3.5812.28±6.3011.82±2.220.608未分类真菌（unclassified fungi）2.97±0.462.67±0.474.50±0.892.48±0.700.152球囊菌门（Mortierellomycota）0.12±0.060.21±0.180.03±0.010.10±0.070.642其他（others）0.04±0.040.13±0.110.10±0.060.03±0.020.593%2.4.2日粮类型对绒山羊瘤胃真菌科水平物种组成的影响（见表4）由表4可知，G1组、G2组、G3组、G4组绒山羊瘤胃真菌的曲霉科分别占32.82%、27.22%、33.17%、29.01%，各组间差异不显著（P0.05）。G1组、G2组新丽鞭毛菌科丰度较G3组、G4组高，但差异不显著（P0.05）。G3组、G4组的棘球菌科丰度极显著高于G1组、G2组（P0.01)。G3组、G4组无节担菌科，但G1组、G2组有节担菌科。G2组的银耳科显著高于其他各组（P0.05），滴虫科显著高于其他各组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.002.T004表4日粮类型对绒山羊瘤胃真菌科水平物种组成的影响项目G1组（苜蓿）G2组（苜蓿补饲精料）G3组（玉米秸秆）G4组（玉米秸秆补饲精料）P值曲霉科（Aspergillaceae）32.82±4.5727.22±6.2233.17±6.7429.01±5.190.855新丽鞭毛菌科（Neocallimastigaceae）19.76±4.6427.34±9.629.25±4.096.61±1.350.068棘球菌科（Trichosphaeriaceae）0.91±0.52b0.60±0.35b18.75±3.29a23.42±9.50a0.006微囊菌科（Microascaceae）3.26±0.831.36±0.495.53±2.282.33±0.690.158节担菌科（Wallemiaceae）4.91±1.00a7.08±3.00a0b0b0.009银耳科Trichosporonaceae）2.82±0.83b6.13±1.66a1.10±0.16b1.84±0.52b0.008滴虫科（Trichomonascaceae）0.62±0.45b6.35±2.13a1.17±0.58b2.07±0.57b0.010其他（others）27.50±3.5622.58±2.6527.42±5.4531.83±4.650.506%2.4.3日粮类型对绒山羊瘤胃真菌属水平物种组成的影响（见表5）由表5可知，G1组、G2组、G3组、G4组绒山羊瘤胃真菌曲霉属占比分别为32.27%，26.34%，32.10%，26.59%。G1、G2组盲肠鞭菌属高于G3组、G4组，但差异不显著（P0.05）。G3组、G4组的黑孢属显著高于G1组、G2组（P0.05）。G2组毛孢子菌属显著高于其他各组（P0.05），滴虫属显著高于其他各组（P0.05），G1组无滴虫属。G1组、G2组有节担菌属，但G3组、G4组无节担菌属。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.002.T005表5日粮类型对绒山羊瘤胃真菌属水平物种组成的影响真菌G1（苜蓿）G2（苜蓿补饲精料）G3（玉米秸秆）G4（玉米秸秆补饲精料）P值曲霉属（Aspergillus）32.27±4.6226.34±6.0032.10±6.9926.59±5.090.803黑孢属（Nigrospora）0.91±0.52b0.60±0.35b18.75±3.29a23.42±9.50a0.006盲肠鞭菌属（Caecomyces）6.79±2.1510.09±6.550.70±0.230.51±0.190.168梨囊鞭菌属（Piromyces）4.68±1.644.93±4.281.11±0.503.38±0.920.651节担菌属（Wallemia）4.91±1.00a7.08±3.00a0b0b0.009续表5　日粮类型对绒山羊瘤胃真菌属水平物种组成的影响 单位：%%10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.23.002.T006真菌G1组（苜蓿）G2组（苜蓿补饲精料）G3组（玉米秸秆）G4组（玉米秸秆补饲精料）P值未分类的真菌（unclassified-k-fungi）2.67±0.0.672.56±0.574.35±1.012.48±0.700.270毛孢子菌属（Cutaneotrichosporon）2.78±0.83b6.07±1.65a0.84±0.29b1.84±0.52b0.007微囊菌属（Microascus）2.02±0.950.65±0.415.12±2.341.72±0.740.135滴虫属（Trichomonascus）0b6.02±2.29a1.17±0.58b1.79±0.67b0.013其他（others）28.75±4.4024.34±4.3730.95±6.7432.99±4.630.6733讨论瘤胃真菌与产甲烷菌共培养会增强对纤维素的降解能力，且对甲烷产生一定影响。目前，数据库中真菌信息不完善，所以真菌分类和丰度可信度不高，并且真菌的18S rRNA高度保守，可能影响鉴定[5-6]。Fotus等[7]对18S rRNA基因进行测序，使用1 000个序列，测定出的OTU个数为21~40个，丰度较高的真菌菌属为Nectria、青霉菌属、Cystofilobasidium和Delphinella。真菌的18S rRNA基因相互间相似性超过97%，因此不能很好地区分瘤胃内真菌种类及表达的多样性。近年来，较多研究使用ITS1序列分析真菌，此序列在进化过程中既稳定又相对变化，对其种属研究有一定帮助。本试验瘤胃真菌多样性通过对ITS1序列进行测序获得639个OTU数目，其中每组均有的OTU为152个，占总数的23.78%；每组独有的OTU个数为苜蓿组（G1）87个、苜蓿补饲精料组（G2）81个、玉米秸秆组（G3）36个、玉米秸秆补饲精料组（G4）37个。本试验研究表明，不同日粮类型对绒山羊瘤胃真菌菌群结构均有一定影响，表明优质牧草可以增加OTU个数。日粮类型对反刍动物瘤胃真菌菌群丰度具有显著影响。Belanche等[8]研究发现，奶牛采食高NDF日粮时，瘤胃内真菌丰富度较高。张洁等[9]对4月龄滩羊瘤胃真菌进行分析，发现舍饲组真菌多样性低于放牧组，物种均匀度高于放牧组，优势菌属的比例与放牧组有所不同。本试验中，各组真菌的Shannon和Simpson指数差异均不显著，补饲精料组的真菌Ace指数、Chaol指数均高于相应牧草组，即补饲精料后真菌物种丰富度有所提高。日粮因素对瘤胃真菌的特性有很大影响。杨宏波等[10]以犊牛为研究对象，发现饲喂高精料全价颗粒饲料会抑制厌氧真菌和瘤胃纤维降解菌的活性。全干草日粮中加入精料或提高精料与粗料的比例可以使瘤胃中真菌数量减少[11]。朱崇淼等[12]研究发现，添加精料可以抑制真菌生成木聚糖异构酶。韩旭峰[13]对陕西绒山羊的研究发现，不同精粗比日粮组真菌优势菌门均为子囊菌门。王照华等[14]进行体外模拟试验发现，不同日粮精粗比会影响真菌优势菌群的比例。付子琳等[15]在成年公滩羊的研究中发现，放牧组优势菌门为新丽鞭毛菌门，舍饲组优势菌门为子囊菌门。徐晓峰等[16]研究发现，随着日粮中精料水平的升高，奶牛瘤胃中真菌的总数降低，但真菌的菌群丰度提升。本研究结果显示，4组绒山羊瘤胃真菌在门水平上的优势菌门均为子囊菌门；其中玉米秸秆及其补饲精料组显著高于苜蓿及其补饲精料组。苜蓿及其补饲精料组的次级优势菌门为新丽鞭毛菌门；玉米秸秆及其补饲精料组的次级优势菌门则是担子菌门。粗料为苜蓿组中新丽鞭毛菌门和担子菌门的相对丰度均高于粗料为玉米秸秆的组。彭碗碗等[17]将葡萄籽添加到多浪羊日粮中，研究其对真菌群落结构的影响，发现多浪羊瘤胃真菌门水平上的优势菌门为新丽鞭毛菌门（Neocallimastigomycot）和子囊菌门（Ascomycota）。本研究从真菌科水平分析得知，苜蓿组、玉米秸秆组、玉米秸秆补饲精料组的优势真菌科为曲霉科，苜蓿补饲精料组的最优势菌科为新丽鞭毛菌科，表明补饲精料会影响真菌科水平优势菌比例。不同厌氧真菌菌属降解植物的能力不同。新丽鞭毛菌属和梨囊鞭菌属降解秸秆的能力较强，盲肠鞭菌属较弱[18]。Sandra等[19]发现，瘤胃中真菌的优势菌群为新丽鞭毛属（Neocallimastix）、梨囊鞭菌属（Piromyces）和奥利霉（Orpinomyces）。本研究中，在属水平上，各组的优势菌属为曲霉属，占比分别为32.27%、26.34%、32.10%、26.59%。补饲精料后曲霉属丰度均低于饲草组，但差异不显著。苜蓿组、苜蓿补饲精料组未分类的新丽鞭毛菌纲丰度显著高于其他两组。玉米秸秆及其补饲精料组均无节担菌科和节担菌属，但其α指数显示物种丰富度较高，原因可能是其他真菌物种丰度较高。4组的梨囊鞭菌属和盲肠鞭菌属均无显著差异。Mao等[20]研究认为，雄性山羊瘤胃真菌群落的优势菌属为新丽鞭毛菌属、根囊鞭菌属和瘤胃壶菌属，与本研究得出不一致的结果，可能是由于动物遗传特性、日粮组成及瘤胃液采集方法等不同而引起。4结论本试验条件下，4组绒山羊瘤胃真菌在门水平上优势菌门均为子囊菌门，玉米秸秆及其补饲精料组显著高于苜蓿及其补饲精料组。苜蓿及其补饲精料组的次级优势菌门为新丽鞭毛菌门；玉米秸秆及其补饲精料组的次级优势菌门是担子菌门。粗料为苜蓿组新丽鞭毛菌门和担子菌门的相对丰度均高于粗料为玉米秸秆组。苜蓿组、玉米秸秆组、玉米秸秆补饲精料组的最优势真菌科为曲霉科，苜蓿补饲精料组的最优势菌科为新丽鞭毛菌科。各组的优势菌属为曲霉属。不同日粮类型以及精料补饲均会在一定程度上影响绒山羊瘤胃真菌的多样性。