山羊传染性胸膜肺炎（CCPP）是一种由山羊支原体山羊肺炎亚种（Mccp）引起的高度接触性传染病，流行于亚非各国。在易感羊群中，CCPP的发病率和病死率分别达100%、80%，可对山羊养殖业造成的巨大经济损失，被世界动物卫生组织（OIE）列为必须报告的疫病之一[1-3]。CCPP的典型病症为高热（41~43 ℃），感染羊群无年龄和性别差异，妊娠母羊易流产[4-5]；病理特征为肺间质及间叶水肿。流行地区的CCPP诊断比较复杂，在临床病理上必须与其他相似的综合症状加以区分，如小反刍兽疫、巴氏杆菌病等[6-8]。临床准确诊断该病通常结合临床症状与实验室方法。常用的实验室方法包括分子生物学检测、病原学诊断和血清学诊断等[9-10]。其中，进行病原分离是确诊CCPP最为特异准确的方法，但Mccp对营养条件要求苛刻，难以体外进行分离培养，非专业实验室一般无法完成分离鉴定；免疫血清学检测方法存在非特异性、实验室仪器设备要求成本高和不易操作等缺点；病原核酸检测则可快速确诊该病。本研究为建立快速进行CCPP临床检测的分子生物学核酸检测方法，以期为后续相关研究提供参考。1材料与方法1.1试验材料CCPP疫苗菌株由哈尔滨兽医研究所辛九庆老师馈赠，巴氏杆菌细菌为本实验室自临床送检病料分离获得。1.2试剂与仪器主要仪器：TaKaRa MiniBest Universal Genomic DNA Extraction kit、TaKaRa Ex Taq RR001A（大连宝生物工程有限公司）；GeneAmp PCR SYSTEM 9700普通PCR仪、ABI 7500 Fast荧光定量PCR仪、荧光定量PCR反应管（ABI公司）；Nanovue Plus微量分光光度仪（GE公司）。主要试剂：Premix Ex TaqTM（Probe qPCR，RR390A）试剂盒、Goldview核酸染色剂（大连宝生物工程有限公司）；琼脂糖、氯仿、异丙醇、无水乙醇等（分析纯，上海生工生物工程技术服务有限公司）。1.3引物及探针根据参考文献[11]及相关GenBank序列设计两对CCPP普通PCR检测引物，荧光定量PCR检测所用引物及探针根据自测序列及相关GenBank序列设计合成，级别为HPLC级的Taqman探针及引物均由大连宝生物公司合成。采用无RNAase酶的PCR级水溶解合成的引物/探针干粉，制备100 mmol/L的引物/探针贮存浓度、20 mmol/L的引物工作浓度、10 mmol/L的探针工作浓度，-80 ℃贮存。普通PCR引物情况见表1，荧光定量PCR引物情况见表2。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.01.005.T001表1CCPP普通PCR检测引物Tab.1Primers of routine PCR for detection of CCPP引物序列（5'→3'）片段大小/bpCCPP-16SFwCGAAAGCGGCTTACTGGCTTGTT548CCPP-16SRvTTGAGATTAGCTCCCCTTCACAGCCPP-arcD-FATCATTTTTAATCCCTTCAAG316CCPP-arcD-RTACTATGAGTAATTATAATATATGCAAXX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.01.005.T002表2CCPP荧光定量PCR引物探针Tab.2Probe and Primers of real-time PCR for detection of CCPP引物序列（5'→3'）片段大小/bpProbe-CCPP-16SCAGGGCTTGACATCCAGTGCAAAGC9316S-tryF1TCGAAGCAACACGAAGAACCTT16S-tryR1CATGCACCACCTGTCTCAATG1.4试验方法1.4.1菌体基因组DNA提取按照提取试剂盒说明书操作。收集1.0~5.0×109菌体细胞，12 000 r/min离心2 min，弃上清；将180 μL Buffer GL、20 μL Proteinase K和10 μL RNase A（10 g/L）加入沉淀，混匀，56 ℃温浴10 min；将上述样本移入吸附柱，12 000 r/min离心2 min，弃滤液后加入500 μL Buffer WA，12 000 r/min离心1 min，弃滤液；再加入700 μL Buffer WB，室温静置1 min，12 000 r/m离心1 min，弃滤液，循环2次。最后将吸附柱安置于一新离心管，将50 μL Elution Buffer加入吸附柱膜中央，室温静置3~5 min，12 000 r/min离心2 min洗脱DNA，弃去吸附柱，收集有DNA液体的离心管，-80 ℃贮存。1.4.2反应体系及反应程序CCPP普通PCR反应液：10×ExTaq buffer 5.0 μL、TaKaRa Ex Taq 0.5 μL、dNTP Mixture 4.0 μL、Primer F 1.0 μL、Primer R 1.0 μL、DNA 1.0 μL、H2O 37.5 μL。反应程序为：95℃ 4 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，循环34次；72 ℃ 10 min。采用2%琼脂糖凝胶跑电泳，紫外成像仪检测扩增结果，拍照记录。荧光定量PCR反应液：Premix Ex Taq（Probe qPCR） 10.0 μL、Primer 16S-tryF1 0.2 μL、Primer 16S-tryR1 0.2 μL、Probe CCPP 16S 0.4 μL、Rox II 0.2 μL、DNA 1.0 μL、H2O 8.0 μL。实时荧光定量PCR反应程序为：95 ℃ 20 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40个循环。1.4.3CCPP普通PCR扩增片段的纯化回收、克隆及序列测定胶回收扩增得到的CCPP 16S及arcD基因片段，克隆连接至pMD-18T Vector，挑取阳性克隆，对获得的阳性克隆进行序列测定和BLAST分析，具体详细操作步骤参见相关的参考文献[12]和[13]。根据获得的基因序列合成荧光定量PCR引物及探针。1.4.4构建标准曲线及敏感性、重复性试验以已构建的CCPP-16S基因pMD-18T载体质粒为标准品，采用Nanovue Plus核酸快速检测仪测定并计算原始质粒的浓度，制备108~100 copies/µL共9个稀释度的标准品，构建CCPP-16S标准曲线并检测敏感性、重复性。1.4.5特异性试验及临床样本检测除对CCPP疫苗株、临床样本进行荧光定量检测外，还对临床上极易混淆的巴氏杆菌等进行鉴别检测，以验证探针及配套引物对的特异性。2结果与分析2.1CCPP普通PCR扩增片段的纯化回收、克隆及序列测定（见图1）由图1可知，根据表1所设计的两对引物对CCPP疫苗株DNA进行常规PCR扩增，均有预期大小片段扩增出。将各预期片段胶回收、纯化，克隆连接至pMD-18T Vector获得阳性克隆，提取质粒进行序列测定和分析；所测序列经网上BLAST比对，均为CCPP相应基因片段的正确序列。根据所测序列设计合成位于16S基因片段的一对引物和配套探针见表2。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.01.005.F001图1CCPP疫苗株两对引物普通PCR扩增结果Fig.1Result of routine PCR of CCPP vaccine strain amplified with the two primer sets注 ： M为DL2 000 Marker；1为引物对CCPP-arcD扩增片段；2为引物对CCPP-16S扩增片段；3为阴性对照。2.2CCPP-16S荧光探针标准曲线的构建（见图2~图4、表3）由图2可知，在103~108 copies/μL浓度之间标准品质粒浓度的对数与Ct值之间存在良好的线性关系，CCPP-16S探针标准曲线的方程式表达为：Y=-3.323 058X+41.844 292，R2=0.998 517，扩增效率为99.95%。上述方程式中Y为Ct值，X为拷贝数的对数，R2为相关系数。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.01.005.F002图2CCPP-16S质粒标准品荧光定量PCR标准曲线Fig.2Standard curve of CCPP-16S standard plasmids real-time PCR由图3可知，以Ct值35为阳性样品临界值，则CCPP-16S 探针对样本的检测敏感性可低至102.06 copies/μL。由图4可知，利用配套引物对进行普通PCR检测时检测敏感度仅为104 copies/μL，较实时荧光定量法的敏感度低近100倍。以优化的反应条件选取103、104、105、106、107 copies/μL的标准模板分别连续扩增3次，结果显示，每个梯度的样本重复性均较好。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.01.005.F003图3CCPP-16S质粒标准品动力学扩增曲线Fig.3Dynamic curve of CCPP-16S standard plasmids注 ： 1~8分别为108、107、106、105、104、103、102、101 copies/μL DNA。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.01.005.F004图4CCPP-16S普通PCR敏感性试验结果Fig.4Sensibility test results of CCPP-16S routine PCR注 ： M为DL2000 Marker；1~9分别为108、107、106、105、104、103、102、101、100 copies/μL；10为阴性对照。由表3可知，组内重复性试验变异系数均小于2.5%，说明该方法具有较好的重复性与稳定性。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.01.005.T003表3荧光定量PCR CCPP-16S质粒标准品的重复性试验结果Tab.3Repeatability test results of real-time PCR for CCPP-16S standard plasmids样品/(copies/μL)3次重复性试验的Ct值Ct平均值标准差变异系数/%12310718.66718.37018.39018.4740.1680.9110621.49821.30321.56421.4550.1360.6310525.53625.75725.53025.6080.1290.5010428.69328.81428.54928.6850.1330.4610331.91631.55931.77531.7500.1790.572.3特异性检测及初步临床应用（见图5）由图5可知，本研究建立的CCPP-16S荧光定量PCR方法仅对CCPP有特异性荧光信号检出，而阴性对照、巴氏杆菌均无荧光信号测出。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.01.005.F005图5CCPP-16S Taqman探针荧光定量PCR检测结果Fig.5Results of CCPP-16S Taqman probe real-time PCR注 ： 1为CCPP-16S质粒阳性对照及CCPP阳性样品；2为阴性对照、巴氏杆菌及阴性样品。3讨论随着技术进步，各种疫病的检测均需实现快速、高效，以便及时应对疫情、准确处置，将损失降至最低。CCPP的病死率极高，危害极其严重，临床诊断中易混淆的疫病也很多；目前，国内外对CCPP的诊断主要依靠病原分离鉴定、血清学试验以及分子生物学技术[14-16]。对比3类诊断方法可知，传统的分离鉴定方法因支原体生长速度慢且生长条件苛刻等特点，无法立即解决快速诊断的问题；而间接血凝试验、补体结合试验与竞争ELISA等血清学试验，因敏感性或特异性较差等缺陷问题，亦无法作为诊断该病原的快检方法。分子生物学技术具有快速、准确、灵敏、特异等优点，尤其是新近发展起来的荧光定量PCR诊断技术。实时荧光定量PCR是一种飞速发展且广泛应用于各行各业的快速定性、定量的检测技术。相对传统的基于抗体而建立的血清学检测方法及普通PCR技术，实时荧光定量PCR技术具有更快速更灵敏的优势，可通过检测病原遗传物质“核酸”对疫病进行快速确诊，进而及时制定疫情处置措施制定相应的治疗方案。4结论本研究基于Mccp 16S rRNA基因初步建立可对CCPP进行快速特异性检测的Taqman探针实时荧光定量PCR检测方法，可快速特异性确诊CCPP，但仍需大量临床样本进行方法的验证和进一步的条件优化。本方法的初步建立为CCPP的快速高通量临床检测提供了一定的技术参考。