中草药饲料添加剂是以中草药为原料制成的用于促进畜禽生长、提高机体免疫力的饲料添加剂[1-2]。与传统的抗生素相比，中草药饲料添加剂具有多成分、多靶点、与机体多系统相互作用等特点[3]。中草药饲料添加剂能够促进动物的生长，提高机体免疫力[4-5]，改善畜产品品质[6]，还能够作为替抗产品，有效避免抗生素的滥用[2,7-8]。复方黄芪饲料添加剂是以黄芪、甘草等中药制成的中草药饲料添加剂。前期研究发现，复方黄芪饲料添加剂具有促进动物生长性能、提高机体免疫和抗氧化能力、改善肉质等作用[9-10]。本研究团队前期建立了复方黄芪饲料添加剂的指纹图谱，并对其所含毛蕊异黄酮苷等黄酮类成分进行表征[11]。毛蕊异黄酮苷、刺芒柄花苷、毛蕊异黄酮是黄芪中异黄酮类成分[12]，甘草苷、甘草酸分别是甘草中二氢黄酮类、三萜皂苷类成分[13]。本研究在此基础上，采用高效液相色谱技术，以复方黄芪饲料中黄芪、甘草等组成药味所含的毛蕊异黄酮苷、甘草苷、刺芒柄花苷、毛蕊异黄酮、甘草酸等5种效用成分[13-14]为指标，建立多指标含量测定方法，保障其质量的稳定性、可控性。1材料与方法1.1仪器设备Waters 2695高效液相色谱仪、2996光电二极管阵列检测器（Waters公司）；AB135-S型电子分析天平；RE-52AA型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；FA 2104型电子分析天平（上海第二分析仪器厂）；KQ3200-E超声波清洗器（昆仑市超声仪器有限公司）；DHG-9075A型电热恒温鼓风干燥箱（上海一恒科技有限公司）；HH-6201210恒温水浴锅（金坛市杰瑞尔电器有限公司）。1.2试验材料与试剂毛蕊异黄酮苷（批号：20633-67-4）、毛蕊异黄酮（批号：20575-57-9）、甘草苷（批号：551-15-5）、甘草酸（批号：1405-86-3），均购自宝鸡市辰光生物科技有限公司；刺芒柄花苷（批号：MUST-17041101）购自成都曼斯特生物科技有限公司。不同批次复方黄芪饲料添加剂为实验室自制（编号：20200601、20200602、20200603）。乙腈（PART NO：05-001）为色谱纯，购自GRACE COMPANY INC.；甲醇为色谱纯，购自天津市四友精细化学品有限公司；磷酸为色谱纯，购自天津市科密欧；水为重蒸水，其余试剂为分析纯。1.3试验方法1.3.1溶液的制备1.3.1.1对照品溶液的制备精密称取毛蕊异黄酮苷对照品16.15 mg、甘草苷对照品31.90 mg、刺芒柄花苷对照品6.30 mg、毛蕊异黄酮对照品6.20 mg、甘草酸对照品31.90 mg，分别加甲醇溶解，10 mL容量瓶定容，得5种指标成分的对照品储备液。分别精密量取毛蕊异黄酮苷（1 615 mg/L）、甘草苷（3 190 mg/L）、刺芒柄花苷（630 mg/L）、毛蕊异黄酮（620 mg/L）、甘草酸（3 190 mg/L）、对照品溶液各135、156、79、79、94 μL，置于10 mL容量瓶，加甲醇至刻度，配置成含毛蕊异黄酮苷21.80 mg/L、甘草苷49.76 mg/L、刺芒柄花苷4.98 mg/L、毛蕊异黄酮4.90 mg/L、甘草酸29.99 mg/L的混合对照品溶液。1.3.1.2供试品溶液的制备取同批次复方黄芪饲料添加剂（批次：20200601）适量，于研钵中研细，精密称取细粉1 g，加50%甲醇，10 mL容量瓶定容，超声处理20 min（功率330 W，频率37 KHZ），静置取上清，使用0.25 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。1.3.2色谱条件优化采用Agela Venusic C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B）为流动相，进行梯度洗脱（梯度1：0~30 min，10%~35% A；30~40 min，35%~55% A；40~50 min，55%~70% A；50~55 min，70%~10% A），流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；进样量10 μL。通过进样1.3.1.2项供试品溶液，对其检测波长进行考察，并对其梯度洗脱程序进行优化。1.3.3复方黄芪饲料添加剂提取方法考察精密称取1.3.1.2项复方黄芪饲料添加剂细粉0.5、1.0、1.5 g，分别加50%甲醇，10 mL容量瓶定容，按1.3.1.2项方法制备不同液料比下供试品溶液。在1.3.2项色谱条件优化基础上，进样1.3.1.1项混合对照品溶液及不同液料比下供试品溶液，根据外标一点法计算不同液料比下供试品溶液中5种指标成分的含量，对其提取工艺进行考察。1.3.4方法学考察1.3.4.1系统适应性考察量取1.3.1.1项下混合对照品溶液600 μL，置于5 mL量瓶中，采用甲醇稀释至刻度，摇匀，参考1.3.2项优化色谱条件进行该混合对照品溶液及1.3.1.1项供试品溶液的HPLC分析，记录各指标成分色谱峰保留时间及与最近色谱峰之间的分离度R、理论塔板数N及拖尾因子T。1.3.4.2线性、检测限、定量限考察量取1.3.1.1项混合对照品溶液适量，加甲醇稀释至6个浓度，即得不同浓度混合对照品溶液。吸取上述混合对照品溶液各10 μL注入液相色谱仪，测定峰面积值。以对照品浓度（g/L）为横坐标（X），峰面积值为纵坐标（Y），绘制标准曲线，考察5种指标成分的线性关系。采用信噪比法测定5种指标成分的检测限（LOD，信噪比S/N=3∶1）及定量限（LOQ，信噪比S/N=10∶1）。1.3.4.3精密度试验精密吸取1.3.1.1项下混合对照品溶液，并参考1.3.2项优化色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积，计算其相对标准偏差（RSD）值。1.3.4.4稳定性试验取复方黄芪饲料添加剂细粉1 g，精密称定，参考1.3.1.2项方法制备供试品溶液，分别于制备后0、2、4、8、12、24 h，参考1.3.2项优化色谱条件进样分析，记录峰面积，计算不同时间下各指标成分峰面积的RSD值。1.3.4.5重复性精密称取同一批次复方黄芪饲料添加剂细粉6份，每份1 g，按1.3.1.2项方法平行制备6份供试品溶液，参考1.3.2项优化色谱条件进行测定，计算复方黄芪饲料添加剂中5种指标成分含量及RSD值。1.3.4.6加标回收率试验精密称取同一批次已知含量的复方黄芪饲料添加剂细粉6份，每份0.5 g，分别精密加入一定量的5种指标成分对照品母液，按1.3.1.2项方法制备供试品溶液，参考1.3.2项优化色谱条件测定5种指标成分的含量，并计算各指标成分平均回收率及RSD值。回收率=(加标试样测定值-试样测定值)/加标量×100%(1)1.3.4.7样品含量测定取不同批次复方黄芪饲料添加剂（20200601、20200602、20200603）细粉各1 g，按1.3.1.2项方法制备各批次供试品溶液，平行制备2份。参考1.3.2项优化色谱条件对供试品溶液中5种指标成分进行测定，记录峰面积，根据各成分线性方程样品中5种指标成分的含量。2结果与分析2.1色谱条件的考察2.1.1不同波长下复方黄芪饲料添加剂色谱（见图1）由图1可知，254、280、320、380 nm检测波长下，随着检测波长的增加，复方黄芪饲料添加剂紫外吸收强度逐渐降低；在10~40 min保留时间内，在254 nm检测波长下，复方黄芪饲料添加剂色谱峰基本分离，随着检测波长的增加，复方黄芪饲料添加剂色谱峰聚集增加、分离度变差。因此，确定254 nm为复方黄芪饲料添加剂的检测波长。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.01.025.F001图1不同波长下复方黄芪饲料添加剂HPLC色谱2.1.2HPLC梯度洗脱程序的优化根据1.3.2项色谱条件，在254 nm检测波长下对其梯度洗脱程序进行优化，复方黄芪饲料添加剂色谱梯度洗脱条件见表1。复方黄芪饲料添加剂色谱梯度优化结果见图2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.01.025.T001表1复方黄芪饲料添加剂HPLC色谱梯度洗脱条件梯度1洗脱时间/min030405055乙腈比例/%1035557010梯度2洗脱时间/min015253540乙腈比例/%103555701010.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.01.025.F002图2复方黄芪饲料添加剂HPLC色谱梯度条件优化结果注：1~5分别为毛蕊异黄酮苷、甘草苷、刺芒柄花苷、毛蕊异黄酮、甘草酸。由图2可知，在前期复方黄芪饲料添加剂色谱梯度洗脱条件下（梯度1），10~40 min保留时间内，复方黄芪饲料添加剂中5个指标成分基本分离；而在优化后的梯度洗脱条件下（梯度2），10~30 min保留时间内，复方黄芪饲料添加剂中5个指标成分色谱峰亦得到良好分离，且色谱峰保留时间度明显缩短。因此，选择优化后的梯度2洗脱程序，在254 nm波长进行检测，复方黄芪饲料添加剂中的5种指标成分色谱峰分离良好、无干扰。2.2复方黄芪饲料添加剂提取方法的考察结果（见表2）由表2可知，在1.3.3项测定条件下，随着提取溶剂量的增加，复方黄芪饲料添加剂中的5种指标成分总含量呈上升趋势，且当液料比超过10 mL/g时，5种指标成分含量趋于平缓。综合考虑色谱峰强度，以10倍量50%甲醇为复方黄芪饲料添加剂的提取溶剂。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.01.025.T002表2复方黄芪饲料添加剂提取方法的考察结果液料比/(mL/g)提取量/(mg/g)毛蕊异黄酮苷甘草苷刺芒柄花苷毛蕊异黄酮甘草酸总量50.387 41.053 60.090 80.122 90.931 62.586 4100.403 61.146 90.102 90.114 80.875 52.643 6200.407 91.029 30.107 20.123 80.927 72.595 92.3方法学考察2.3.1系统适应性（见图2）记录图2复方黄芪饲料添加剂供试品溶液、混合对照品溶液色谱图（梯度2）中的5种指标成分色谱峰分离度R、理论塔板数N、拖尾因子T。结果表明，复方黄芪饲料添加剂5种指标成分色谱峰与邻近色谱峰之间的分离度R均大于1.5，5种指标成分色谱峰理论塔板数N均大于10 000，5种指标成分色谱峰拖尾因子T介于0.90~1.10，表明该方法系统适应性良好。2.3.25种指标成分的线性、检测限及定量限结果（见表3）由表3可知，1.3.4.2条件下测得的毛蕊异黄酮苷、刺芒柄花苷、毛蕊异黄酮、甘草苷、甘草酸等5种指标成分在测定范围内线性关系良好。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.01.025.T003表35种指标成分的线性、检测限及定量限结果项目线性回归方程相关系数线性范围/(mg/L)LOD/(mg/L)LOQ/(mg/L)毛蕊异黄酮苷y=28 615x-46 8340.999 82.48~159.000.110.37甘草苷y=4 860.3x+2 201.40.999 75.00~320.000.792.53刺芒柄花苷y=36 399x-359.340.999 70.25~16.000.120.39毛蕊异黄酮y=35 418x-2 514.30.999 70.25~16.000.100.34甘草酸y=6 773.2x-10 6580.999 65.00~320.000.662.132.3.3精密度试验结果（见表4）由表4可知，在1.3.4.3条件下测得的5种指标成分峰面积RSD值均小于2%或等于2%，表明仪器精密度良好。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.01.025.T004表4精密度试验结果 （n=6）项目峰面积/(AU·min)平均值RSD/%123456毛蕊异黄酮苷609 023601 108602 473583 965585 294589 077595 1671.75甘草苷274 407263 777269 027277 507272 746273 354271 8031.76刺芒柄花苷74 07976 58475 02073 07873 78872 86074 2351.87毛蕊异黄酮74 35473 64674 48571 01672 01071 82472 8892.00甘草酸292 942287 057288 181279 329284 130282 748285 7311.662.3.4稳定性试验结果（见表5）由表5可知，复方黄芪饲料添加剂中5种指标成分的色谱峰面积RSD值均小于3%，表明样品溶液在24 h内稳定。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.01.025.T005表5稳定性试验结果 （n=6）项目峰面积/(AU·min)平均值RSD/%0 h2 h4 h8 h12 h24 h毛蕊异黄酮苷994 3441 064 7141 032 5071 030 554998 374988 1001 018 0992.91甘草苷284 148290 940296 310282 320280 192290 880287 4652.16刺芒柄花苷324 163321 998337 549326 419315 057313 638323 1372.68毛蕊异黄酮356 951346 881360 144353 136337 958342 767349 6402.45甘草酸506 881514 270515 255503 218483 567497 179503 3952.362.3.5重复性试验结果（见表6）由表6可知，复方黄芪饲料添加剂中5种指标成分含量的RSD值均小于3%，表明本方法重复性良好。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.01.025.T006表6重复性试验结果 （n=6）项目含量/(mg/g)平均值RSD/%123456毛蕊异黄酮苷0.452 50.445 90.433 10.454 80.469 20.436 00.448 62.96甘草苷0.977 71.014 51.048 41.033 41.006 91.043 91.020 82.61刺芒柄花苷0.099 70.100 50.101 10.102 10.107 90.101 00.102 12.92毛蕊异黄酮0.133 80.137 40.131 20.138 30.139 00.130 70.135 12.71甘草酸0.597 20.584 20.580 20.600 90.585 90.612 20.593 42.052.3.6加样回收率试验结果（见表7）由表7可知，复方黄芪饲料添加剂中5种指标成分平均回收率在95%~105%，对应的RSD值均小于3%，表明本方法准确度良好。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.01.025.T007表7加样回收率试验结果项目样品中量/μg加入量/μg测得量/μg回收率/%平均回收率/%RSD/%毛蕊异黄酮苷110.54109.35217.6397.9498.681.95112.60109.35218.2096.57115.25109.35223.6199.10109.14109.35216.8198.46115.51109.35227.28102.21114.84109.35221.7697.78甘草苷256.22248.82516.54104.62104.442.70262.24248.82511.55100.20248.36248.82511.14105.61261.02248.82531.81108.83262.86248.82521.41103.91261.32248.82518.83103.49刺芒柄花苷25.1673.68102.75105.31104.402.8725.6373.68100.83102.0725.7673.6899.0299.4325.5073.68104.37107.0326.2373.68104.33105.1024.8473.68103.34106.55毛蕊异黄酮33.2963.6798.45102.34104.212.4033.9163.67101.74106.5334.0963.6797.81100.0933.7563.67101.35106.1834.7163.67101.73105.2532.8763.6799.66104.90甘草酸154.46299.86445.1196.93100.332.29157.27299.86452.1898.35148.95299.86450.25100.48156.54299.86465.59103.06157.64299.86463.53102.01156.72299.86460.01101.142.4样品含量测定（见表8）由表8可知，在1.3.4.7条件下测得的3批复方黄芪饲料添加剂中毛蕊异黄酮苷、甘草苷、刺芒柄花苷、毛蕊异黄酮、甘草酸的含量均值分别为0.43、1.06、0.11、0.14、0.60 mg/g，5种指标成分总量均值为2.34 mg/g。由上述5种指标成分含量均值的80%确定5种成分的含量限度，即复方黄芪饲料添加剂中毛蕊异黄酮苷、甘草苷、刺芒柄花苷、毛蕊异黄酮、甘草酸的含量分别不得低于0.34、0.85、0.09、0.11、0.48 mg/g，5种指标成分总量不得低于1.87 mg/g。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.01.025.T008表8复方黄芪饲料添加剂中5种指标成分的含量（n=3）项目不同批次饲料中指标成分含量(mg/g)平均值RSD/%123毛蕊异黄酮苷0.428 20.418 00.442 70.429 62.90甘草苷1.050 50.998 01.135 71.061 46.55刺芒柄花苷0.107 50.110 10.112 90.110 22.45毛蕊异黄酮0.141 20.135 20.130 80.135 83.84甘草酸0.595 80.623 40.600 70.606 72.433讨论3.1复方黄芪饲料添加剂色谱条件的优化本研究通过光电二极管阵列检测器，对254、280、320、380 nm等不同检测波长下复方黄芪饲料添加剂的色谱峰的检测波长进行优化，结果表明，复方黄芪饲料添加剂色谱峰在254 nm检测波长下基本分离。随着检测波长的增加，复方黄芪饲料添加剂色谱峰紫外吸收强度明显降低，色谱峰聚集、分离度变差。因此，选择254 nm作为复方黄芪饲料添加剂的检测波长。此外，本研究以乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B）为流动相，在254 nm检测波长下，对复方黄芪饲料添加剂的色谱洗脱条件进行考察，结果表明，在优化后的梯度2洗脱程序下，复方黄芪饲料添加剂中的5个指标成分色谱峰分离良好、无干扰。3.2复方黄芪饲料添加剂提取方法的考察本试验中，复方黄芪饲料添加剂中的毛蕊异黄酮苷、甘草苷、刺芒柄花苷、甘草酸等指标成分的极性较大，而毛蕊异黄酮则极性偏弱[15]；复方黄芪饲料添加剂由黄芪中药复方提取物、蔗糖、糊精配制而成，仅以甲醇、乙醇为溶剂难以有效提取所有的效用成分[16]。此外，与乙醇相比，甲醇无紫外吸收，在光电二极管阵列检测器中，不会对5种指标成分的检测造成干扰。因此，本研究选取50%甲醇为提取溶剂，采用超声提取法，考察不同液料比（5、10、20 mL/g）下，复方黄芪饲料添加剂中5个指标成分的含量。结果表明，采用液料比10 mL/g，超声提取20 min，能够有效提取出复方黄芪饲料添加剂中的5种指标成分。3.3复方黄芪饲料添加剂样品的含量测定黄芪中具有的毛蕊异黄酮苷、刺芒柄花苷、毛蕊异黄酮等异黄酮类及甘草中甘草苷、甘草酸等二氢黄酮和三萜皂苷类成分具有较好的抗氧化、免疫调节等生物活性[17-19]。本研究以毛蕊异黄酮苷、甘草苷、刺芒柄花苷、毛蕊异黄酮、甘草酸等成分为指标，建立了复方黄芪饲料添加剂中5个指标成分同时检测的其含量测定方法。3个批次复方黄芪饲料添加剂的含量测定结果表明，毛蕊异黄酮苷、甘草苷、刺芒柄花苷、毛蕊异黄酮、甘草酸5种指标成分在不同批次饲料样品中含量相对稳定，5种指标成分的含量均值分别为0.43、1.06、0.11、0.14、0.60 mg/g，5种指标成分的总量均值为2.34 mg/g。在上述指标成分平均含量基础上下浮动20%，制定本制剂中指标成分的含量限度，即毛蕊异黄酮苷、甘草苷、刺芒柄花苷、毛蕊异黄酮、甘草酸的含量分别不得低于0.34、0.85、0.09、0.11、0.48 mg/g，5种指标成分总量不得低于1.87 mg/g。4结论本方法简便、准确、灵敏度高、重现性好，可作为复方黄芪饲料添加剂中毛蕊异黄酮苷、甘草苷、刺芒柄花苷、毛蕊异黄酮、甘草酸等5种指标成分的含量测定方法。