肠道上皮是抵御有害抗原和病原体的关键屏障，氧化应激可产生氧自由基造成肠道损伤，损害肠道健康[1]。因此，可通过降低肠道氧自由基产生，提高肠道抗氧化能力，进而改善肠道健康。同时，肠道也是营养物质消化吸收的主要器官[2]，肠上皮组织易受到外界各种物质的刺激，产生大量活性氧（ROS）引发氧化应激，最终导致肠道结构受损，破坏肠道屏障的完整性[3]。通过提高肠道紧密连接蛋白相关基因Occludin、Claudin和JAM-A的表达量可改善肠道健康。RES是一种多酚类物质[4]。RES主要来自葡萄酒、浆果和花生等，具有多种生物活性，如抗糖化、抗氧化、抗炎等[5]。Kaindl等[6]研究表明，RES可通过直接或间接的抗氧化作用显著抑制过度氧化应激，有效防止脂肪酸氢过氧化物诱导的氧化应激，减少对肠道的氧化损伤。Hu等[7]研究表明，RES可通过降低活性氧（ROS）水平，缓解人肠道氧化应激损伤。Liang等[8]研究表明，RES可显著提高猪小肠IPEC-1细胞中紧密连接蛋白相关基因ZO-1、Claudin-1和Occludin的表达水平，增加紧密连接的完整性，防止IPEC-1细胞中氧化应激介导的ROS产生。本试验以“杜×长×大”育肥猪为研究对象，探讨RES对其空肠抗氧化能力以及紧密连接蛋白相关基因表达的影响，以期为RES在育肥猪饲粮中的应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料RES购自西安万方生物科技有限公司。12头体重约为65 kg育肥猪由广西大学科研基地养殖场提供。CAT、T-SOD、T-AOC、GSH-Px和MDA试剂盒，购自南京建成生物工程研究所；实时荧光定量（RT-PCR）反转录试剂盒购自TaKaRa公司。1.2试验设计12头育肥猪随机分为2组，每组6头。对照组育肥猪饲喂基础饲粮，试验组育肥猪饲喂在基础饲粮中添加400 mg/kg的RES。试验期41 d。试验最后1 d，禁食12 h后全部屠宰，采集新鲜的空肠于冻存管，液氮保存。基础饲粮组成及营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.01.006.T001表1基础饲粮组成及营养水平原料组成含量/%营养水平合计100.00玉米74.93消化能/(MJ/kg)13.19豆粕(43%)11.00粗蛋白/%13.35麸皮5.50粗灰分/%10.23豌豆3.00粗纤维/%8.00葵花籽仁粕2.00赖氨酸/%0.53预混料1.98氯化钠/%0.24石粉0.95钙/%0.45磷酸氢钙0.55磷/%0.35蛋氨酸羟基类似物0.09注：1.预混料购自南宁扬翔股份有限公司。2.营养水平均为计算值。1.3总RNA提取及cDNA合成取空肠组织约1 g于EP管，加入1 mL RIPA裂解液和4颗研磨珠，50 Hz频率研磨5 min。以提取的总RNA作为模板，按照反转录试剂盒说明书反转录为cDNA。首去除基因组DNA，聚合酶链式反应（PCR）反应条件为：42 ℃孵育2 min，4 ℃保存，将第一步得到的反应10 μL加入第二步反转录体系中。PCR反应条件为：37 ℃反应15 min， 85 ℃反应5 s。反转录产物cDNA－4 ℃保存。反转录PCR体系见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.01.006.T002表2反转录PCR体系体系组成体积合计205×primeScript Buffer Ⅱ4RT primer Mix1primeScript RT Enzyme MixⅠ1RNase-free H2O4第一步反应液10μL1.4引物设计Occludin、Claudin-1、JAM-A、铜/锌超氧化物歧化酶（Cu/Zn-SOD）、锰超氧化物歧化酶（Mn-SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶-1（GPx-1）、谷胱甘肽过氧化物酶-4（GPx-4）和18S rRNA[9-15]基因引物及自行设计的CAT、T-SOD、GSH-Px和MDA基因引物送至南宁捷尼斯生物科技有限公司合成。RT-PCR引物序列见表3。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.01.006.T003表3RT-PCR引物序列基因引物序列（5'→3'）扩增长度/bpOccludinF：GCTGGAGGAAGACTGGATR：ATCCGCAGATCCCTTAAG244Claudin-1F：GGCCCTTACCTTTCGCCTGAR：GCCTCAGGGCTTGGTGTTCT158AM-AF：AATCAGTGTTCCCTCCTCTGCTACR：ACGGTTGCTCTTGGGCTCT122Cu/Zn-SODF：CAGGTCTCACTTCAATCCR：CCAAACGACTTCCAGCAT255Mn-SODF：GGACAAATCTGAGCCCTAACGR：CCTTGTTGAAACCGAGCC159GPx-1F：TGGGGAGATCCTGAATTGR：GATAAACTTGGGGTCGGT183GPx-4F：GATTCTGGCCTTCCCTTGCR：TCCCCTTGGGCTGGACTTT172CATF：ACGCCTGTGTGAGAACATTGR：GTCCAGAAGAGCCTGAATGC124T-SODF：GAGACCTGGGCAATGTGACTR：CCAAACGACTTCCAGCATTT189GSH-PxF：AGCCCAACTTCATGCTCTTCR：CATTGCGACACACTGGAGAC159MDAF：AGCCACAGATCAGCCAAGTCR：TCCCATGGTGCCTGAATCAC18118S rRNAF：CCCACGGAATCGAGAAAGAGR：TTGACGGAAGGGCACCA1221.5测定指标及方法1.5.1空肠抗氧化指标的测定将空肠组织剪约0.1 g至EP管，加入0.9 mL生理盐水，以50 Hz频率研磨10 min，使组织释放其中的抗氧化物。按照说明书步骤提取组织蛋白，按照CAT、T-SOD、T-AOC、GSH-Px和MDA说明书进行操作。1.5.2空肠抗氧化基因及紧密连接蛋白相关基因表达的测定以cDNA为模板进行RT-PCR。RT-PCR反应体系为10 μL：SYBR® premix Ex TaqTM Ⅱ 5 μL、上下引物各0.25 μL、无RNA酶水2 μL、cDNA 2.5 μL。RT-PCR扩增程序：95 ℃预变性30 s，95 ℃ 变性5 s，60 ℃ 退火30 s，65 ℃延伸 5 s，45个循环。1.6数据统计与分析按照2-∆∆Ct方法计算空肠组织中各基因mRNA表达水平，采用SPSS 22.0软件对数据进行独立样本t检验。结果以“平均值±标准误”表示，P0.05表示差异显著，P0.01表示差异极显著。2结果与分析2.1RES对育肥猪空肠抗氧化酶活性的影响（见表4）由表4可知，与对照组相比，RES组育肥猪空肠中T-AOC以及CAT、T-SOD、GSH-Px的活性均显著提高（P0.05）；MDA含量显著降低（P0.05），较对照组低70.78%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.01.006.T004表4RES对育肥猪空肠抗氧化酶活性的影响组别CAT/(U/mg prot)T-SOD/(U/mg prot)T-AOC/(U/mg prot)GSH-Px/(U/mg prot)MDA/(μmol/g prot)对照组4.41±0.16b47.55±0.86b0.53±0.07b259.44±3.03b2.19±0.20aRES组12.74±0.18a59.56±2.28a1.79±0.04a316.18 ±1.24a0.64±0.07b注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。2.2RES对育肥猪空肠抗氧化酶相关基因mRNA表达的影响（见表5）由表5可知，RES组的酶基因CAT、T-SOD和GSH-Px的mRNA表达水平均显著高于对照组（P0.05）；MDA的mRNA表达水平显著低于对照组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.01.006.T005表5RES对育肥猪空肠抗氧化酶活相关基因mRNA表达的影响组别CATT-SODGSH-PxMDA对照组1.00±0.01b1.00±0.02b1.00±0.06b1.00±0.02aRES组1.13±0.02a1.13±0.05a1.12±0.01a0.43±0.01b2.3RES对育肥猪空肠抗氧化基因mRNA表达的影响（见表6）由表6可知，RES组的抗氧化基因Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、GPx-1和GPx-4的mRNA表达水平均显著高于对照组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.01.006.T006表6RES对育肥猪空肠抗氧化基因mRNA表达的影响组别Cu/Zn-SODMn-SODGPx-1GPx-4对照组1.00±0.03b1.00±0.03b1.00±0.02b1.00±0.02bRES组1.36±0.01a1.31±0.01a1.35±0.02a1.19±0.02a2.4RES对育肥猪空肠紧密连接蛋白相关基因mRNA表达的影响（见表7）由表7可知，RES组紧密连接蛋白Occlidin、Claudin-1和JAM-A的mRNA表达水平均显著高于对照组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.01.006.T007表7RES对育肥猪空肠紧密连接蛋白相关基因mRNA表达的影响组别OcclidinClaudin-1JAM-A对照组1.00±0.01b1.00±0.02b1.00±0.04bRES组1.24±0.03a1.23±0.01a1.33±0.03a3讨论3.1RES对育肥猪空肠抗氧化酶活性的影响抗氧化系统和氧化系统之间的不平衡导致ROS过量，过量的ROS可破坏细胞信号和功能，引起细胞膜和线粒体损伤，细胞凋亡、坏死，导致机体损伤[16]。CAT、T-SOD、T-AOC、GSH-Px等抗氧化酶可对抗因ROS过量引起的机体氧化应激损害[17]。研究表明，RES可通过激活抗氧化酶系统保护机体免受氧化损伤[18]。曾子悠[19]研究表明，饲粮中添加RES可显著提高断奶仔猪血清和背最长肌中T-AOC及T-SOD、GSH-Px的活性，降低MDA的含量。Zhang等[20]研究表明，在饲粮中添加RES可显著增强生长肥育猪肌肉中T-AOC和GSH-Px的活性。本研究结果表明，饲粮中添加400 mg/kg的RES显著提高育肥猪空肠中T-AOC及CAT、T-SOD、GSH-Px的活性，显著降低MDA的含量，表明RES具有显著提高育肥猪空肠抗氧化能力的作用。研究表明，RES可通过清除过量的ROS，显著提高杜长大猪空肠抗氧化能力，改善肠道健康。3.2RES对育肥猪空肠抗氧化酶相关基因的影响CAT、T-SOD和GSH-Px构成了最初的抗氧化防御系统，GSH-Px和CAT间存在一定的互补作用[21]。Kumar等[22]研究表明，通过调节大鼠心脏抗氧化酶活相关基因CAT和SOD的表达可减少成纤维细胞内ROS的积累。Zheng等[23]研究表明，氧化应激可导致仔猪空肠抗氧化酶相关基因CAT-1、CAT-2和CAT-3表达下调，血浆中MDA的含量增加。Liu等[24]研究发现，小鼠口服补充RES 30 d，显著上调肠道抗氧化酶相关基因CAT、T-SOD和GSH-Px的表达水平，降低肠道中MDA的表达水平。本研究发现，饲粮中添加400 mg/kg的RES可显著提高杜长大猪空肠中CAT、T-SOD和GSH-Px的mRNA表达水平，降低MDA的mRNA表达水平。结果表明，RES具有显著上调杜长大猪空肠抗氧化酶活相关基因表达水平的作用。3.3RES对育肥猪空肠抗氧化基因表达的影响机体内产生大量的ROS时，过量的ROS可诱发动物机体脂质、蛋白质和DNA的损伤[25]。在氧化应激状态下，仔猪空肠中Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、GPx-1和GPx-4的mRNA水平显著下调[25]。也有研究表明，RES可显著上调大鼠心脏抗氧化基因Mn-SOD和小鼠细胞中GPx-1和GPx-3的mRNA表达水平[26-27]。本研究发现，饲粮中添加400 mg/kg的RES可显著提高杜长大猪空肠中Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、GPx-1和GPx-1的表达水平，结果表明，在饲粮中添加400 mg/kg的RES可显著上调育肥猪空肠抗氧化基因的表达水平。3.4RES对育肥猪空肠紧密连接蛋白表达水平的影响肠上皮屏障的功能和完整性主要由紧密连接调控，Occludin蛋白通过磷酸化在紧密连接的组装和通透性中发挥了重要的作用[28]。Occludin是细胞极性蛋白，主要具有栅栏作用和屏障调节功能[29]，JAM-A主要参与紧密连接的维持和调控[30]。肠道TJ屏障的破坏，造成管腔内有害分子的渗透，引起肠道产生氧化应激[31]。在抗氧化剂和氧化系统失衡的情况下，过量的ROS可通过减少紧密连接和细胞数量破坏上皮细胞和肠道屏障的完整性，威胁肠道健康[32]。Cao等[33]研究表明，采用RES预处理可防止过氧化氢刺激的仔猪空肠Occludin和ZO-1的磷酸化水平降低。Liang等[8]研究表明，RES可显著提高猪小肠IpEC-1细胞中紧密连接蛋白相关基因ZO-1、Claudin-1和Occludin的表达水平，增加紧密连接的完整性，防止IPEC-1细胞中氧化应激介导的ROS产生。因此，本试验进一步验证育肥猪空肠紧密连接蛋白相关基因Claudin-1、Occlidin和JAM-A的表达情况，结果显示，饲粮中添加400 mg/kg的RES可显著上调杜长大猪空肠紧密连接蛋白Claudin-1、Occlidin和JAM-A的mRNA表达水平，改善肠道健康。4结论综上所述，在“杜×长×大”育肥猪基础饲粮中添加400 mg/kg RES，可显著提高育肥猪空肠抗氧化能力及上调空肠紧密连接蛋白相关基因的表达水平，改善肠道健康。