生物胺是一类具有生物活性的含氮低分子碱性有机化合物[1-2]。常见的生物胺包括组胺、腐胺、尸胺、精胺、亚精胺、酪胺等[3]。动物体内高浓度的生物胺具有一定毒害作用，其中组胺毒性最大，酪胺次之；其他生物胺的存在均可增强组胺和酪胺的不良作用[4]。目前，生物胺的测定方法包括：色谱法（高效液相色谱法[5-6]、气相色谱法[7]）、酸碱度变化法[8]、分子生物学法[9-10]、微生物学法[11-12]、免疫识别法[13-14]、酶促反应法[15-16]。饲料行业中，高效液相色谱法灵敏度、准确度高，是目前最常用的检测方法[17]。但高效液相色谱法需要将待测样品进行柱前衍生，而衍生受温度、衍生时振荡等操作影响，进而影响检测结果。本研究建立了离子交换色谱柱后衍生法同时测定6种生物胺的检测方法，可获得较好的分离效果和回收率，保证样品的检测稳定性，且前处理步骤简单，可快速批量检测动物源性原料和饲料。1材料与方法1.1仪器与试剂主要仪器：AE240分析天平（梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司）、SB-3200DT超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）、HY-2A多用调速振荡器（江苏金怡仪器科技有限公司）、IMS-150全自动雪花制冰机（常熟市学科电器有限公司）、HWS-12电热恒温水浴锅（上海一恒科学仪器有限公司）、LG-22高速冷冻离心机（四川蜀科仪器有限公司）、S433D氨基酸分析仪（赛卡姆（北京）科学仪器有限公司）。主要试剂：5-磺基水杨酸（以下简称磺基水杨酸）、石油醚，分析纯（成都市科隆化学品有限公司）；乙腈，色谱纯（北京迈瑞达科技有限公司）；异丙醇，色谱纯，（西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司）；盐酸，优级纯（成都市科隆化学品有限公司）；柠檬酸、硼酸、EDTA、三水合乙酸钠、乙酸钾、乙酸，均为分析纯（广东光华科技股份有限公司）；茚三酮，分析纯（赛卡姆（北京）科学仪器有限公司）；抗坏血酸、氢氧化钾、氯化钾，均为优级纯（天津市科密欧化学试剂有限公司）。有证生物胺标准储备溶液：含组胺、腐胺、尸胺、精胺、亚精胺、酪胺，各组分浓度均为1.0 mmol/L，由赛卡姆（北京）科学仪器有限公司生产。标准品：组胺二盐酸盐（纯度≥99%）、腐胺二盐酸盐（纯度≥99.9%）、尸胺二胺盐酸（纯度≥99.7%）、亚精胺三盐酸盐（纯度≥99.9%）、精胺四盐酸盐（纯度≥98.0%）和酪胺盐酸盐（纯度≥98.9%），由Dr. Ehrenstorfer公司生产。1.2试验方法1.2.1标准溶液的配制标准工作液：准确移取1.0 mL有证生物胺标准储备溶液至10 mL棕色容量瓶，采用0.1 mol/L盐酸溶液定容至刻度，配制浓度为100 μmol/L的混合生物胺标准工作液，2~8 ℃冰箱储存。标准工作系列溶液：准确移取适量100 μmol/L的混合生物胺标准工作液，水稀释定容成系列标准溶液，浓度分别为：2、5、10、25、50、100 μmol/L。加标标准储备溶液（1 g/L）：分别称取82.8 mg组胺二盐酸盐（纯度≥99%）（精确至0.01 mg）、91.4 mg腐胺二盐酸盐（纯度≥99.9%）、85.7 mg尸胺二胺盐酸（纯度≥99.7%）、87.7 mg亚精胺三盐酸盐（纯度≥99.9%）、86.0 mg精胺四盐酸盐（纯度≥98.0%）和63.3 mg酪胺盐酸盐（纯度≥98.9%），分别置于50 mL棕色容量瓶，使用0.1 mol/L盐酸溶液溶解并定容，－18 °C以下保存。1.2.2样品制备参考GB/T 20195—2006制备试样，固体样品要求粉碎后样品可过孔径0.45 mm筛。1.2.3样品前处理准确称取待测样品5 g（精确至0.000 1 g）于100 mL具塞三角瓶，准确加入50 mL 2%磺基水杨酸溶液（边加入液体边振荡，防止样品团簇结块），室温下200 r/min振荡提取60 min，取上清液于50 mL离心管中，4 ℃ 10 000 r/min离心30 min。1.2.4色谱检测条件色谱柱：Cation Separation Column，LCA K17，4.6 mm×30 mm，赛卡姆（北京）科学仪器有限公司。流动相：柠檬酸K液A1（pH值=5.75），柠檬酸K液B1（pH值8.30），RegSol K。柠檬酸K液A1：准确称取11.2 g氢氧化钾（GR）、14.0 g一水合柠檬酸（AR）、14.9 g氯化钾（GR）于1 L烧杯中，加入1 L超纯水溶解，混匀，水相滤膜过滤，上机。柠檬酸K液B1：准确称取16.8 g氢氧化钾（GR）、16.0 g一水合柠檬酸（AR）、10.0 g硼酸（AR）、164.0 g氯化钾（GR）于1 L烧杯中，加入1 L超纯水溶解、混匀，水相滤膜过滤，上机。RegSol K：准确称取33.7 g氢氧化钾（GR）、0.2 g EDTA（AR）于1 L烧杯中，加入1 L超纯水溶解，混匀，水相滤膜过滤，上机。洗脱程序见表1。柱温：70 °C。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.01.026.T001表1洗脱程序时间/minA-1/K/%B-1/K/%RegSol K/%流速/(mL/min)0802000.450.1802000.456.0287200.4514.0287200.4515.0010000.4516.5010000.4522.0090100.4525.0080200.4528.0070300.4531.0065350.4531.1001000.4534.0001000.4534.1802000.4544.0802000.4544.1802000.4544.2802000.00衍生反应系统：衍生剂为茚三酮溶液，清洗液为20%~60%异丙醇溶液；茚三酮溶液起始时间0 min，停止时间34 min，其余时间为异丙醇溶液冲洗时间；反应器温度130 °C；流速0.25 mL/min。茚三酮溶液：称取20 g茚三酮，加600 mL甲醇溶解，再加钾钠缓冲液（分别称取196.0 g乙酸钾、272.0 g三水乙酸钠加水溶解、200 mL乙酸加水稀释至1 000 mL），而后依次加入2 mL苯酚、0.2 g抗坏血酸，混匀。检测器：可见光检测器，检测波长570 nm。1.2.5加标回收试验准确添加加标标准储备溶液于空白样品中使其含量分别为25.0、200.0、1 000.0 mg/kg。经样品前处理后，上机检测测定回收率，每个添加水平设6次重复。2结果与分析2.1提取溶液的选择（见表2）本方法采用离子交换色谱柱为磺酸型离子色谱柱，考虑色谱柱的耐受性和目标样品蛋白含量，故选用磺基水杨酸溶液（酸性条件下，其阴离子可与带正电荷的蛋白质结合形成不溶性蛋白盐）作为样品中生物胺的提取液。由表2可知，采用2%磺基水杨酸溶液可得较好的提取效果。因此，选用2%磺基水杨酸溶液作为样品生物胺的提取溶液。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.01.026.T002表2不同提取溶剂的考察结果项目生物胺含量/(mg/kg)水1%磺基水杨酸溶液2%磺基水杨酸溶液5%磺基水杨酸溶液组胺1414.849522.533545.750548.8682415.920520.216546.717522.725平均值415.38521.37546.23535.80相对偏差/%0.130.220.092.44腐胺1143.014187.189194.686196.9362143.268186.976196.104186.847平均值143.14187.08195.40191.89相对偏差/%0.090.060.362.63尸胺1630.079791.844826.249830.7482633.018797.448829.584787.925平均值631.55794.65827.92809.34相对偏差/%0.230.350.202.65亚精胺13.50715.96218.19519.26623.36113.97917.10817.081平均值3.4314.9717.6518.17相对偏差/%2.136.623.086.01精胺12.1497.75811.09411.54721.7926.35010.99012.635平均值1.977.0511.0412.09相对偏差/%9.069.980.474.51酪胺1129.413146.713146.024140.6672121.365146.691151.934143.292平均值125.39146.70148.98141.98相对偏差/%3.210.011.980.922.2生物胺提取时间的考察结果（见表3）10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.01.026.T004项目生物胺含量/(mg/kg)15 min30 min45 min60 min75 min90 min亚精胺114.55914.60515.07015.65816.29716.174215.63814.10113.98214.53114.72214.947平均值15.1014.3514.5315.0915.5115.56相对偏差/%3.571.763.753.735.083.94精胺17.1776.7228.2689.7889.9349.94528.5346.6797.4859.3298.3959.636平均值7.866.707.889.569.169.79相对偏差/%8.640.324.972.408.401.58酪胺1136.314137.892142.965145.531139.222138.9282133.271142.381148.403148.381144.672147.877平均值134.79140.14145.68146.96141.95143.40相对偏差/%1.131.601.870.971.923.12由表3可知，6种生物胺采用2%磺基水杨酸溶液于200 r/min振荡提取60 min，生物胺的提取效果较好，能够满足试验要求。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.01.026.T003表3生物胺提取时间的考察结果项目生物胺含量/(mg/kg)15 min30 min45 min60 min75 min90 min组胺1530.282527.867534.909539.653535.395541.2822530.233528.614535.451535.925536.10541.492平均值530.26528.24535.18537.79535.75541.39相对偏差/%0.000.070.050.350.070.02腐胺1190.133189.889190.788193.497191.809193.8582189.823189.287191.904193.049193.265193.685平均值189.98189.59191.35193.27192.54193.77相对偏差/%0.080.160.290.120.380.04尸胺1811.651805.494808.718812.313807.000816.5432807.098807.671816.746814.146820.463818.673平均值809.37806.58812.73813.23813.73817.61相对偏差/%0.280.130.490.110.830.13续表3　生物胺提取时间的考察结果2.3生物胺提取样液的净化（见图1）由图1可知，选用2%磺基水杨酸溶液提取样品，所得样液为乳液状态。样液呈乳液状态可能是由于其含有的水和蛋白或者水、油脂和蛋白形成了混合分散系。因此，为满足上机条件，选取二氯甲烷和4%磺基水杨酸溶液进一步净化处理样液，破坏样液的乳液状态，除去样液中蛋白和油脂。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.01.026.F001图1样液净化前后对比以鱼粉为考察对象，使用2%磺基水杨酸溶液进行提取。取一定量提取后的样液，加入4%磺基水杨酸溶液和二氯甲烷，样液、4%磺基水杨酸溶液和二氯甲烷的体积比为2∶1∶2；200 r/min振荡30 min，4 ℃ 10 000 r/min离心30 min，二氯甲烷层与水相层间有白色沉淀生成。取水相样液过滤，样液状态透明澄清。本方法将2%磺基水杨酸溶液提取后的样液，经4%磺基水杨酸溶液和二氯甲烷处理净化，取处理后的水相样液使用1 mol/L氢氧化钾溶液调节pH值（pH值≥3.0），过滤后上机检测。2.4设备衍生稳定性（见表4、图2）由表4、图2可知，采用氨基酸分析仪自带衍生系统进行标准溶液衍生后，标准品峰面积相对标准偏差在0.20%~0.90%之间，系统衍生稳定性较好。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.01.026.T005表4设备衍生稳定性项目123456平均值RSD/%峰面积组胺4 955.24 972.64 964.44 976.24 961.94 950.54 963.50.20腐胺9 311.89 339.49 425.39 371.29 355.19 443.39 374.30.54尸胺6 613.56 642.36 771.26 717.36 739.06 675.56 693.10.90亚精胺14 817.314 618.114 761.814 683.514 735.514 766.314 730.40.48精胺20 775.020 667.220 912.720 720.620 921.520 615.720 768.80.61酪胺6 042.06 089.76 146.66 113.46 116.06 000.16 084.60.8910.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.01.026.F002图2生物胺标准溶液色谱分离图注：保留时间作为出峰先后顺序：1组胺、2腐胺、3尸胺、4亚精胺、5精胺、6酪胺。2.5方法的线性关系及灵敏度（见表5）由表5可知，以标准溶液浓度为X轴，响应峰面积为Y轴制作线性方程，6种生物胺在2~100 μmol/L浓度范围内具有良好的线性，各生物胺相关系数均大于0.999 9，相关性好。6种生物胺的检出限为5.0 mg/kg，定量限为10.0 mg/kg。满足生物胺检测的要求。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.01.026.T006表5各生物胺线性及相关系数项目2 μmol/L5 μmol/L10 μmol/L25 μmol/L50 μmol/L100 μmol/L回归方程相关系数检出限/（mg/kg）定量限/（mg/kg）峰面积组胺104.10252.68512.321 290.372 575.825 023.88Y=50.553X0.999 95.010.0腐胺183.06463.35965.062 299.734 750.659 373.49Y=93.912X0.999 9尸胺140.85338.64615.511 681.283 386.566 748.85Y=67.480X0.999 9亚精胺282.33708.371 363.433 617.777 405.9514 960.10Y=148.970X0.999 9精胺330.07880.831 915.285 049.9710 398.5221 409.97Y=212.110X0.999 6酪胺112.36241.05467.991 482.402 747.985 483.67Y=54.999X0.999 52.6方法准确度及精密度（见表6~表8、图3）由表6可知，白鱼粉中添加6种生物胺，样品中生物胺浓度为25.0 mg/kg的回收率在83.46%~111.34%之间，6个平行样品的回收率相对标准偏差在1.31%~5.13之间，表明方法重复性较好。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.01.026.T007表6白鱼粉中添加生物胺浓度25.0 mg/kg的回收率试验（n=6）项目123456平均值RSD组胺103.71103.54105.98105.42105.98102.87104.581.31腐胺108.70106.08106.75107.44102.79103.20105.832.23尸胺90.2390.7190.9788.3192.5783.9789.463.37亚精胺108.40107.39107.80108.26111.34102.86107.682.55精胺101.77102.7096.16103.3494.14104.57100.454.23酪胺101.3790.29100.80104.8395.8498.6798.635.13%由表7可知，样品中生物胺浓度为200.0 mg/kg的回收率在98.90%~108.61%之间，表明方法的添加回收率较高；6个平行样品的回收率相对标准偏差在0.38%~1.22%之间，表明方法具有良好重复性。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.01.026.T008表7白鱼粉中添加生物胺浓度200.0 mg/kg的回收率试验（n=6）项目123456平均值RSD组胺106.27105.07106.15105.57105.39105.08105.590.49腐胺108.44107.84108.61108.20107.22107.80108.020.47尸胺100.29100.37100.67101.7399.70100.35100.520.67亚精胺108.03108.21108.36108.35107.27108.08108.050.38精胺101.34103.50102.14102.0499.90100.78101.621.22酪胺99.38101.6698.90100.39100.44101.97100.461.21%由表8可知，样品中生物胺浓度为1 000.0 mg/kg的回收率为100.02%~109.98%。6个平行样品的回收率相对标准偏差为1.33%~2.20%，表明方法具有良好重复性。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.01.026.T009表8白鱼粉中添加生物胺浓度1000.0 mg/kg的回收率试验（n=6）组别123456平均值RSD组胺109.98108.46109.15106.11106.73107.59108.001.36腐胺110.72109.76109.78106.62108.15109.14109.031.33尸胺104.20102.49104.18100.22101.34103.57102.671.58亚精胺110.18108.96109.55105.82107.60108.37108.411.43精胺103.60105.73105.19100.02103.02100.96103.092.20酪胺103.71105.32101.90100.63102.99101.85102.731.61%图3为白鱼粉加标浓度为200 mg/kg的色谱分离图。生物胺的出峰位置相对独立，不受杂质干扰。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.01.026.F003图3加标浓度为200.0 mg/kg的白鱼粉的色谱分离图注：保留时间作为出峰先后顺序：1组胺、2腐胺、3尸胺、4亚精胺、5精胺、6酪胺。本试验中，在白鱼粉中添加6种生物胺标准溶液，样品中各生物胺浓度25.0~1 000.0 mg/kg的回收率在83.46%~111.34%之间，6个平行样品的回收率相对标准偏差均在0.38%~5.13%之间，表明方法具有良好重复性。2.7方法的适应性（见表9）本方法测定饲料中涉及动物源性的饲料及原料，包括鱼粉、鱼排粉、肉骨粉、鸡肉粉、虾粉、鱿鱼膏、蟹壳粉、血浆蛋白粉、血球蛋白粉、黑水虻、蟹料等，考察方法的适应性。由表9可知，本方法适用于不同种类动物源性饲料中生物胺的测定。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.01.026.T010表96种生物胺方法适应性检测结果项目组胺腐胺尸胺亚精胺精胺酪胺白鱼粉1#ND27.30ND15.30NDND白鱼粉2#57.7358.63416.3130.9725.0291.89国产鱼粉1#219.34454.551 802.7243.5316.30554.51国产鱼粉2#166.50478.312 147.2227.8219.65603.23鱼排粉1#320.44357.581 018.8913.0810.00100.47鱼排粉2#65.50339.681 680.9414.4415.96358.88猪肉骨粉1#55.21186.18521.7311.1910.00130.62猪肉骨粉2#10.00108.30329.8010.458.8690.56鸡肉粉1#10.0056.14227.6912.8128.2140.84鸡肉粉2#40.05219.17418.2033.2139.78128.47虾粉1#343.282 819.004 764.7056.7296.391 829.03虾粉2#52.831 424.452 896.03ND10.00984.61鱿鱼膏1#60.69203.40401.6518.2815.13293.12鱿鱼膏2#10.00280.21964.2744.3210.00309.36蟹壳粉154.59503.701 890.0024.0811.47487.65血浆蛋白粉1#10.00109.18353.85ND11.2522.72血浆蛋白粉2#13.3889.17169.48ND28.4037.93血球蛋白粉1#10.00＜10.0025.1516.3085.6610.53血球蛋白粉2#10.1125.3132.8014.0183.1424.11黑水虻1#ND＜10.0018.6627.1710.0015.37黑水虻2#10.0021.84364.9193.12ND31.47蟹料162.7281.33241.4760.9610.0054.21注：ND表示小于检出限5.0 mg/kg。mg/kg3结论本试验采用2%磺基水杨酸溶液作为提取液，采用4%磺基水杨酸溶液和二氯甲烷净化提取后样液，建立了离子交换色谱-柱后衍生法测定动物源性饲料原料及饲料中的生物胺，可较好地分离6种生物胺。该方法不需要在前处理过程中衍生，具有较好的准确性和精密度，适用于鱼粉、鱼排粉、肉骨粉、鸡肉粉、虾粉、鱿鱼膏、蟹壳粉、血浆蛋白粉、血球蛋白粉、黑水虻、蟹料等动物源性饲料原料及饲料中生物胺的测定。