动物细菌感染是畜牧养殖业面临的重大难题，其中奶牛乳腺炎是危害奶牛产业常见的疾病，可降低牛奶产量及品质[1-3]。木糖葡萄球菌（Staphylococcu sxylosus, S. xylosus）是革兰氏阳性凝固酶阴性葡萄球菌（coagulase negative staphylococci，CNS），通常从亚临床乳腺炎中被分离[4-6]。该菌种被认为是非致病菌，但也是致病奶牛乳腺炎的菌种之一[7-8]。木糖葡萄球菌生物膜形成能力较强，其生物膜的形成是感染以木糖葡萄球菌为主导致的疾病治疗复杂化。生物被膜是一种复杂的三维结构，由细胞聚集物组成，这些细胞聚集物包裹在细胞外聚合物自我生成的基质中，相互粘附或粘附在表面上。形成的具有一定结构的菌体可保护细菌抵抗恶劣环境。细菌在体外生物被膜的形成导致其对抗生素类药物产生较强的耐药性，使得感染持续、发作反复而难以治愈，为动物医学的临床治疗带来巨大挑战[9-11]。我国于2020年7月发文，明确禁止在饲料中添加抗生素类添加剂，使科研工作者在挖掘新型抗生素替代品上需要重大突破[12-13]。大黄酸是中国传统中药大黄的提取物，具有抗菌、抗炎、抗氧化应激、抗病毒等多种药理活性[14]，其结构类型为蒽醌类化合物。已有研究表明[15]，大黄酸在抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）方面效果突出，但对于大黄酸抗木糖葡萄球菌生物被膜的研究尚未见报道。本研究以木糖葡萄球菌生物被膜为研究对象，考察中药有效成分大黄酸对木糖葡萄球菌生物被膜的作用，探索大黄酸干预木糖葡萄球菌生物被膜形成的作用机制，以期为预防木糖葡萄球菌及其生物被膜相关感染提供参考。1材料与方法1.1试验材料木糖葡萄球菌ATCC700404由东北农业大学提供，购自美国；木糖葡萄球菌谷氨酰胺酶缺失株和木糖葡萄球菌咪唑甘油磷酸酯脱水酶缺失株由东北农业大学赠予。大黄酸购自上海麦克林生化科技有限公司。1.2大黄酸对木糖葡萄球菌体外最小抑菌浓度MIC测定根据美国临床实验室标准化协会（CLSI）规定的肉汤稀释法敏感性试验执行标准，使用标准微量稀释法进行木糖葡萄球菌对大黄酸MIC的测定。在无菌操作下，精确称取大黄酸用无水乙醇溶解其浓度为1 024 mg/L。将大黄酸稀释溶液依次加入至无菌96孔组织培养板中，每排的第1~11孔，每孔90 μL，药物浓度从1 024 mg/L至1 mg/L。1.3药物浓度对大黄酸干预木糖葡萄球菌生物被膜形成的影响取出于-20 ℃冰箱中储存的木糖葡萄球菌，活化，菌液使用TSB液体培养基稀释浓度为1×106 CFU/mL，取200 μL稀释后的菌液加到96孔板内，分别加入1/8MIC、1/16MIC、1/32MIC和1/64MIC（浓度）大黄酸，平行3次重复试验，37 ℃培养24 h，固定。采用结晶紫溶液染色量化处理后，酶标仪测定OD570 nm值。1.4亚抑菌浓度大黄酸对木糖葡萄球菌谷氨酰胺酶缺失株生物被膜形成的影响取出于-20 ℃冰箱中储存的木糖葡萄球菌谷氨酰胺酶缺失株，活化，使用无菌TSB液体培养基接种，菌液稀释至1×106 CFU/mL，于96孔板内加入稀释好的菌液200 μL，加入终浓度依次为1/8MIC、1/16MIC、1/32MIC和1/64MIC大黄酸，平行3次重复试验，37 ℃培养24 h，染色后取出微孔板于酶标仪中测定OD570 nm值。1.5亚抑菌浓度大黄酸对木糖葡萄球菌咪唑甘油磷酸酯脱水酶缺失株生物被膜形成的影响取出木糖葡萄球菌咪唑甘油磷酸酯脱水酶缺失株活化，菌液用TSB液体培养基稀释浓度为1×106 CFU/mL，于96孔板内加入稀释好的菌液200 μL，加入终浓度依次为1/8MIC、1/16MIC、1/32MIC和1/64MIC大黄酸，平行3次重复试验，37 ℃培养24 h，染色后取出微孔板于酶标仪中测定OD570 nm值。1.6大黄酸对木糖葡萄球菌生物被膜形成不同时间点的影响确定有效干预木糖葡萄球菌生物被膜的大黄酸浓度后，对大黄酸在不同时间点抑制木糖葡萄球菌生物被膜的干预作用进行进一步探索。试验方法按照1.3进行，将大黄酸加入稀释后的木糖葡萄球菌菌液中，使其终浓度8 mg/L，37 ℃培养，分别在3、6、12和24 h取出微孔板，平行3次重复试验，染色后取出微孔板于酶标仪中测定OD570 nm值。1.7谷氨酰胺酶对大黄酸干预木糖葡萄球菌生物被膜形成阶段研究方法同1.6，分别使木糖葡萄球菌ATCC700404与谷氨酰胺酶缺失株在TSB中生长，并将过夜培养物浓度稀释为1×106 CFU/mL，将大黄酸加入至稀释后的木糖葡萄球菌菌液中，37 ℃培养，分别于3、6、12、24 h取出，所有孔均采用无菌PBS洗涤，平行3次重复试验，用结晶紫指示剂染色，于酶标仪中测定OD570 nm值。2结果与分析2.1大黄酸对木糖葡萄球菌的MIC通过标准微量稀释法测定大黄酸对木糖葡萄球菌的抑制作用。当大黄酸浓度为64 mg/L时，孔内菌液呈现澄清状态，表明大黄酸对木糖葡萄球菌的MIC为64 mg/L。2.2药物浓度对大黄酸干预木糖葡萄球菌生物被膜形成的影响（见图1、表1）由图1可知，亚MIC浓度为1/8MIC、1/16MIC、1/32MIC和1/64MIC的大黄酸均可极显著减少生物被膜形成（P0.01），表明在大黄酸的作用下，木糖葡萄球菌生物被膜的形成受到明显干预作用。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.01.016.F001图1大黄酸浓度对木糖葡萄球菌生物被膜形成的干预作用注：与对照组相比，*表示差异显著（P0.05），**表示差异极显著（P0.01）；下图同。由表1可知，随着药物浓度增加，生物被膜干预效果越好，表明大黄酸对木糖葡萄球菌的抑制呈现出浓度依赖性。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.01.016.T001表1亚抑菌浓度大黄酸对木糖葡萄球菌的抑制作用项目1/8MIC1/16MIC1/32MIC1/64MIC抑制率/%54.40±0.6644.96±0.5137.90±0.3225.66±0.352.3大黄酸对木糖葡萄球菌谷氨酰胺酶缺失株生物被膜形成的影响（见图2）图2不同浓度大黄酸对木糖葡萄球菌谷氨酰胺酶缺失株生物被膜的干预作用10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.01.016.F2a1（a）大黄酸对木糖葡萄球菌谷氨酰胺酶缺失株生物被膜形成的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.01.016.F2a2（b）大黄酸对木糖葡萄球菌谷氨酰胺酶缺失株生物被膜抑制作用由图2（a）可知，与未添加大黄酸的木糖葡萄球菌谷氨酰胺酶缺失株相比，亚抑菌浓度大黄酸能够显著抑制木糖葡萄球菌谷氨酰胺酶缺失株生物被膜的形成，生物被膜形成能力明显削弱。由图2（b）可知，以正常木糖葡萄球菌组作为对照，各亚抑菌浓度下谷氨酰胺酶缺失株抑制率均极显著降低（P0.01）。结果表明，在谷氨酰胺酶缺失的情况下，大黄酸仍然对生物被膜的形成有影响，但抑制率显著下降。大黄酸抑制木糖葡萄球菌生物被膜的形成可能是通过多靶点发挥生物被膜的干预作用，且谷氨酰胺酶为其中靶点之一。2.4大黄酸对木糖葡萄球菌咪唑甘油磷酸酯脱水酶缺失株生物被膜形成的影响（见图3）图3不同浓度大黄酸对木糖葡萄球菌咪唑甘油磷酸酯脱水酶缺失株生物被膜的干预作用10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.01.016.F3a1（a）大黄酸对木糖葡萄球菌咪唑甘油磷酸酯脱水酶生物被膜形成的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.01.016.F3a2（b）大黄酸对木糖葡萄球菌咪唑甘油磷酸酯脱水酶生物被膜的抑制作用由图3（a）可知，与未加入大黄酸的木糖葡萄球菌对照菌液相比，使用不同亚抑菌浓度大黄酸处理咪唑甘油磷酸酯脱水酶缺失株形成生物被膜的能力极显著降低（P0.01），生物被膜的形成均受到严重抑制。由图3（b）可知，以正常木糖葡萄球菌组作为对照，1/32MIC和1/64MIC大黄酸浓度下咪唑甘油磷酸酯脱水酶缺失株的抑制率极显著降低（P0.01）；1/16MIC大黄酸浓度下，咪唑甘油磷酸酯脱水酶缺失株的抑制率显著降低（P0.05）；但1/8MIC大黄酸浓度时，咪唑甘油磷酸酯脱水酶缺失株与正常木糖葡萄球菌相比差异不显著（P0.05）。结果显示，咪唑甘油磷酸酯脱水酶缺失后，大黄酸仍然能够干预木糖葡萄球菌生物被膜的形成，其抑制率显著下降，趋势明显，特别是在大黄酸浓度较低时抑制率降低更显著。研究表明，咪唑甘油磷酸酯脱水酶是大黄酸抑制木糖葡萄球菌生物被膜形成的靶点，且为多靶点发挥生物被膜的干预作用。2.5大黄酸对木糖葡萄球菌生物被膜形成不同时间点的影响（见图4、表2）由图4可知，与菌液对照组相比，在3、6、12、24 h，大黄酸均能够极显著抑制生物被膜形成（P0.01）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.01.016.F004图4大黄酸在不同时间点对生物被膜的干预作用由表2可知，大黄酸在6 h和12 h对木糖葡萄球菌的抑制率最高。结果表明，大黄酸在各时间点对木糖葡萄球菌生物被膜形成均有抑制效果，特别是在生物被膜形成早期黏附阶段最为突出。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.01.016.T002表2大黄酸在不同时间点对木糖葡萄球菌的抑制作用项目3 h6 h12 h24 h抑制率/%62.52±1.2575.94±0.6374.75±0.7553.51±0.592.6谷氨酰胺酶对大黄酸干预木糖葡萄球菌生物被膜形成阶段的影响（见图5）图5大黄酸在不同时间点对谷氨酰胺酶缺失株生物被膜的干预作用10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.01.016.F5a1（a）大黄酸在不同时间点对木糖葡萄球菌谷氨酰胺酶缺失株生物被膜形成的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.01.016.F5a2（b）大黄酸在不同时间点对木糖葡萄球菌谷氨酰胺酶缺失株生物被膜的抑制作用由图5（a）可知，与对照组相比，大黄酸在3、6、12、24 h均对谷氨酰胺酶缺失株生物被膜形成具有干预作用（P0.01）。由图5（b）可知，与正常木糖葡萄球菌组相比，谷氨酰胺酶缺失株在6 h和12 h极显著抑制生物被膜的形成（P0.01）。结果表明，大黄酸与谷氨酰胺酶作用对生物被膜的干预时期为生物被膜形成早期。3讨论生物被膜的形成包括早期黏附、表面微菌落的聚集、分化成熟及脱落几个阶段[16]。细菌形成生物被膜，将会大大提高其在恶劣环境下的生存概率，膜内细菌与浮游细菌相比，其对药物的敏感性将会降低1 000倍以上，耐药性显著增强。在生物被膜的保护下，免疫细胞及抗生素将难以侵入生物被膜中杀灭细菌，导致临床治疗困难[17-18]。木糖葡萄球菌生物被膜的形成是治疗以奶牛乳腺炎为主的疾病困难化的关键问题。因此，现阶段新型抗菌药物研发的主要方向是以抑制细菌生物被膜的形成为主。细菌生物被膜形成常被代谢过程所控制，氮代谢在生物被膜形成中起关键性作用[19]。在大多数生物体的细胞反应中，谷氨酰胺作为氮元素的提供者由谷氨酰胺酶催化产生，谷氨酰胺酶在木糖葡萄球菌中的表达对抑制生物被膜的形成发挥重要作用[20]。细菌的氮代谢水平受L-组氨酸的影响，而咪唑甘油磷酸酯脱水酶在L-组氨酸的生物合成中起关键作用[21]。因此，本试验选择这两种蛋白缺失株对大黄酸干预木糖葡萄球菌生物被膜形成机制进行初步探索。目前，越来越多的中药被发现具有较好的抑菌效果。但中药成分复杂，而中药单体有明确的化学结构及理化性质，更利于研究。以中药大黄的提取物大黄酸为主的抗菌活性为导向，在研发新型抗菌药、开发中药饲料添加剂方面具有广阔的应用前景[22-24]。本试验结果表明，在亚MIC浓度下药物大黄酸对木糖葡萄球菌生物被膜具有明显的干预作用。生物被膜总量随着药物浓度的增加不断减少，呈现一定的剂量依赖性，与大多数药物产生抑制作用的趋势相同。在大黄酸干预木糖葡萄球菌生物被膜形成的机制研究中发现，细菌谷氨酰胺酶缺失株形成生物被膜的能力显著降低，各亚抑菌浓度药物大黄酸抑制率均显著下降，但药物浓度越高，其抑制率呈现上升趋势；细菌咪唑甘油磷酸酯脱水酶缺失株生物被膜的形成能力也显著降低，其抑制率在低药物浓度显著降低，增加药物浓度抑制率相应上升，在1/8MIC药物浓度时，咪唑甘油磷酸酯脱水酶缺失株抑制率未显著下降，呈现的趋势与谷氨酰胺酶缺失株基本相符，表明谷氨酰胺酶和咪唑甘油磷酸酯脱水酶是大黄酸干预木糖葡萄球菌生物被膜的作用靶点，且为多靶点发挥生物被膜的干预作用。咪唑甘油磷酸酯脱水酶缺失株出现高药物浓度抑制率上升的原因可能是高药物浓度大黄酸与其他靶标作用较强。大黄酸干预细菌生物被膜形成时间主要在6 h和12 h，为生物被膜形成的早期黏附阶段。研究发现，药物对生物被膜的干预作用也大多在生物被膜形成黏附期；大黄酸与谷氨酰胺酶作用时间也主要集中在6 h和12 h[25-26]，与本试验结果相符，说明大黄酸在生物被膜形成早期发挥干预作用。原因可能是谷氨酰胺酶在大黄酸作用下对生物膜形成早期的一些蛋白质或基因的作用，或者由于抗菌剂和QS系统抑制剂能显著抑制早期生物膜的形成[27]。上述研究表明，大黄酸干预木糖葡萄球菌生物被膜的形成是通过多靶点发挥生物被膜的干预作用，且谷氨酰胺酶及咪唑甘油磷酸酯脱水酶为其可能重要靶点。本研究将进一步对大黄酸干预木糖葡萄球菌生物被膜的形成进行深入研究。4结论大黄酸能够有效抑制木糖葡萄球菌生物被膜的形成，且干预生物被膜的形成是通过多靶点发挥作用，以谷氨酰胺酶、咪唑甘油磷酸酯脱水酶为其靶点发挥干预作用，其中大黄酸对生物被膜的干预时期为生物被膜形成的早期阶段，可能是通过抑制细菌黏附发挥干预生物被膜形成的作用。