纤维素是植物光合作用的产物[1]。纤维素酶是一组复合酶系的总称。目前，关于芽孢杆菌产纤维素酶的研究较多。芽孢杆菌可在不适宜生长的环境下形成芽孢，适应各种极端环境[2]，产生大量的酶、抗菌化合物等[3]，可在代谢过程中产生多种酶和抗菌物质[4]。董丹等[5]从白酒糟中分离得到产纤维素酶的解淀粉芽孢杆菌。Noratiqah等[6]从白蚁肠道分离得到1株芽孢杆菌，且内切葡聚糖酶酶活高达138.77 U/g。Sreena等[7]从白蚁的肠道中分离得到2株可产生纤维素酶和纤维二糖酶的芽孢杆菌（Bacillus sp.），产生的纤维素酶活性分别可达2.98、5.06 U/mg，产生的纤维二糖酶活性分别可达3.42、6.01 U/mg。贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）属芽孢杆菌属，是一类广泛存在于环境中的多功能细菌。贝莱斯芽孢杆菌属革兰氏阳性细菌，菌体成杆状，可产孢子，广泛分布于自然界的水体、土壤、空气、植物根系、植株表面和动物肠道等[8-10]。据报道，贝莱斯芽孢杆菌符合添加剂授权条件[11]。Li等[12]研究发现，贝莱斯芽孢杆菌作为饲料添加剂时，动物机体内的肠道微生物菌群结构能够得到改善。因此，本试验探究贝莱斯芽孢杆菌在不同条件下的产酶能力，获得其产纤维素酶的最适条件，以期为贝莱斯芽孢杆菌在饲料添加剂领域中应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1试验菌株贝莱斯芽孢杆菌由本实验室自台湾乳白蚁肠道内分离鉴定，现保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M2021357。1.1.2主要试剂羧甲基纤维素钠（北京博奥拓达科技有限公司）、葡萄糖（AR，西陇化工股份有限公司）、3，5-二硝基水杨酸（上海鼓臣生物技术有限公司）；四水合酒石酸钾钠、无水亚硫酸钠（广州化学试剂厂）；蔗糖、纤维二糖、麦芽糖、乳糖、可溶性淀粉（上海源叶生物有限公司）；Mueller-Hinton（MH）肉汤（青岛高科技工业园海博生物技术有限公司）；NaOH、Na2HPO4、KH2PO4、HCl、MgSO4·7H2O、柠檬酸（西陇科学股份有限公司）；苯酚（天津市大茂化学试剂厂）。1.1.3主要仪器D hG-9245A电热恒温鼓风干燥箱（上海一恒科技公司）；CD-215KS/252KSA冰箱（青岛海尔电器有限公司）；SW-CJ-1F超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；SA8旋涡振荡器（江苏新康医疗器械有限公司）；JC-C hP-80Q恒温培养箱（杭州聚同电子有限公司）；JA1003电子天平（上海精密仪器仪表有限公司）；JCJ-RO-0.5T超纯水净化装置（莱特莱德水处理公司）；PRP500台式离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）；YZM-60BI高温高压灭菌锅（广州市豪尔生医疗设备有限公司）；PT-3502PC酶标仪（北京普天新桥技术有限公司）；hh-501S水浴锅（金坛区金城春兰实验仪器厂）。1.2主要试剂配制1.2.1羧甲基纤维素钠培养基（1%）的配制称取5.0 g羧甲基纤维素钠（CMC-Na），分量依次溶于100 mL蒸馏水，75 ℃水浴加热，逐步加入1.0 g酵母浸出物、0.15 g MgSO4·7H2O、2.0 g KH2PO4，补充蒸馏水至500 mL，121 ℃高压灭菌15 min，置于超净工作台冷却。1.2.23,5-二硝基水杨酸（DNS）溶液的配制按照《中国药典》的方法[13]，准确称量6.3 g 3,5-二硝基水杨酸，加入300 mL蒸馏水，45 ℃水浴溶解；加入21 g NaOH，搅拌溶解，分别加入182 g四水合酒石酸钾钠、5.0 g苯酚、5.0 g无水亚硫酸钠，45 ℃水浴搅拌至完全溶解。转移至1 000 mL的棕色容量瓶，加蒸馏水定容，振荡混匀。锡纸包裹，避光静置7 d。1.2.3磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液的配制参考文献[14]，称取21.014 g柠檬酸溶解，定容至1 000 mL，配制0.1 mol/L柠檬酸缓冲液；称取71.628 g磷酸氢二钠，定容至1 000 mL，配制0.2 mol/L磷酸氢二钠缓冲溶液。不同pH值磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液的配制见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.01.017.T001表1不同pH值磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液的配制pH值Na2 HPO4/mL柠檬酸/mL4.69.3510.655.010.309.705.411.158.855.812.097.916.213.226.786.614.555.457.016.473.537.418.171.831.2.4粗酶液的制备取甘油保存的1 mL贝莱斯芽孢杆菌接种至灭菌LB培养基，37 ℃恒温摇床，180 r/min培养18 h制备菌悬液，转接至1% CMC液体培养基，37 ℃、180 r/min培养一定时间；取出培养液6 500 r/min离心10 min，取上清作为粗酶液，加热煮沸后作为空白对照进行纤维素酶酶活力的检测[15]。1.3不同条件下酶活力测定1.3.1接种量对酶活力的影响取100 mL的无菌发酵培养基，分别按4%、6%、8%、10%、12%的接种量进行接种，37 ℃培养36 h。取1 mL发酵培养液，6 500 r/min离心10 min，取200 μL上清液置于1.5 mL无菌离心管中，分别加入200 μL的CMC培养基和6张1 cm×1 cm的滤纸片；加入200 μL蒸馏水，45 ℃水浴30 min，冷却，加300 μL的DNS溶液，沸水浴10 min，冷却，加入蒸馏水300 μL，振荡混匀，560 nm处测吸光值。1.3.2培养时间对酶活力的影响取100 mL的无菌发酵培养基，接种1.3.1中测定的最适菌液的百分量，37 ℃培养24 h取样，每隔12 h 取样，采用DNS法测定酶活。1.3.3温度对酶活力的影响取1.3.1中最适接种量的菌液进行发酵培养，发酵培养时间为1.3.2所得的最适培养时间时进行取样。水浴温度分别置为35、45、55、65 ℃，采用DNS法测定酶活。1.3.4pH值对酶活力的影响采用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液分别配制初始pH值为4.6、5.0、5.4、5.8、6.2、6.6、7.0、7.4的CMC发酵培养基，采用DNS法测定酶活。1.3.5培养底物对酶活力的影响采用6种碳源营养物替换CMC底物，分别为：乳糖、麦芽糖，可溶性淀粉、麦麸、蔗糖、纤维二糖，浓度为1%，其他条件分别为1.3.1、1.3.2、1.3.3和1.3.4所测得的最适反应条件。分别进行发酵培养，采用DNS法测定对应的酶活。1.3.6计算酶活M=C×N×1 000T×V (1)式中：M为酶活力；C为根据葡萄糖标准曲线中计算所得葡萄糖的浓度；N为酶液稀释总倍数；T为反应时间；V为样品体积[16]。1.4数据统计与分析数据采用WPS Office 2021进行整理，进行相应的绘图和计算。2结果与分析2.1葡萄糖标准曲线取1 g/L的葡萄糖标准溶液配制终浓度分别为0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 g/L的标准液，加入0.15 mL的DNS混匀后沸水浴10 min，冷却，加入0.65 mL蒸馏水，混匀，560 nm处测吸光值。以葡萄糖的含量为纵坐标，OD值为横坐标，葡萄糖标准曲线见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.01.017.T002表2葡萄糖标准曲线试剂葡萄糖标准液/mL蒸馏水/mLDNS试剂/mL糖含量/mg000.200.15010.020.180.150.0220.040.160.150.0430.060.140.150.0640.080.120.150.0850.100.100.150.102.2不同接种量对酶活性的影响（见表3、表4）由表3、表4可知，当接种量小于8%时，随着接种量升高，酶活力有所提升，二者呈正相关；当接种量为8%时，酶活力最高，滤纸酶活尤为明显；当接种量大于8%时，随着接种量升高，酶活力呈下降趋势。结果表明，并非接种量越高酶活力越高，当营养物质有限时，菌体生长可能会出现竞争性抑制，产酶能力受到影响。本试验中，接种量为8%时，贝莱斯芽孢杆菌纤维素酶活和滤纸酶活达到峰值，分别为1.333、1.724 U/mL。因此后续试验中，采用8%的菌液接种量进行研究。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.01.017.T003表3不同接种量对纤维素酶活性的影响接种量/%对照组试验组ΔOD酶活/(U/mL)12340.4900.6220.6030.6080.1210.39560.4450.6180.6180.6010.1671.30180.4810.6640.6390.6470.1691.333100.4920.6220.6150.6340.1320.604120.4760.6230.5590.6020.1190.35010.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.01.017.T004表4不同接种量对滤纸酶活性的影响接种量/%对照组试验组ΔOD酶活/(U/mL)12340.7290.8320.8370.8280.1030.05060.7360.8430.8400.8500.1080.14880.6430.8700.8290.7970.1891.724100.6420.7800.7140.7950.1210.395120.7060.8260.8250.8280.1200.3822.3不同发酵时间对酶活性的影响（见表5、表6）由表5、表6可知，随着发酵时间的增长，对应的纤维素酶活和滤纸酶活均有所提升。当培养时间达到48 h时，滤纸酶活达到峰值，酶活力为7.188 U/mL，随后呈下降趋势；当培养时间达到72 h时，滤纸酶活基本趋近于0，而此时的纤维素酶活达到峰值酶活力为6.542 U/mL；培养时间达84 h时，纤维素酶活呈下降趋势，但仍可保持较高的酶活（6.123 U/mL）。因此，后续的试验中，纤维素酶活的最适测定时间为72 h，滤纸酶活为48 h。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.01.017.T005表5不同发酵时间对纤维素酶活性的影响培养时间/h对照组试验组ΔOD酶活/(U/mL)123240.4000.4630.4440.5300.0793.042360.4150.5040.5070.5030.0903.650480.8900.9871.0051.0180.1135.001600.4190.5300.5400.5340.1165.134720.4590.5690.6290.6000.1406.542840.4540.5380.6680.5550.1336.12310.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.01.017.T006表6不同发酵时间对滤纸酶活性的影响培养时间/h对照组试验组ΔOD酶活/(U/mL)123240.7770.8850.7610.7720.0290.188360.8670.8670.8600.9870.0380.683480.4480.5910.6000.6080.1527.188600.7940.8100.8390.8700.0461.139720.8980.9230.9220.9290.0270.0552.4不同温度对酶活性的影响（见表7、表8）由表7、表8可知，在不同发酵温度下，贝莱斯芽孢杆菌表现出不同的酶活性。该菌株在不超过65 ℃可保持较高的纤维素酶活和滤纸酶活，且在45 ℃时达到峰值；当温度达到65 ℃时，滤纸酶活趋近于0。因此，纤维素酶活、滤纸酶活最佳的发酵温度均为45 ℃。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.01.017.T007表7不同温度对纤维素酶活性的影响培养温度/℃试验组ΔOD酶活/(U/mL)123350.0540.0680.2890.1376.351450.2460.1720.3070.24212.324550.1750.1010.2550.1778.634650.0130.1530.1630.1104.79210.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.01.017.T008表8不同温度对滤纸酶活性的影响培养温度/℃试验组ΔOD酶活/(U/mL)123350.1330.1660.3060.20210.042450.2120.2660.3690.28214.645550.1950.0040.1040.1014.297650.0230.0450.0300.0330.3982.5不同pH值对酶活性的影响（见表9、表10）由表9可知，当pH值低于5.4时，贝莱斯芽孢杆菌纤维素酶活较低，其酶活值趋于0。随着pH值升高，其酶活力有所提升，至6.6时达到峰值（26.496 U/mL）；当pH值为7.4时，仍保持较高的纤维素酶活，说明该菌株在弱酸至中性环境下产纤维素酶的能力较好。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.01.017.T009表9不同pH值对纤维素酶活性的影响pH值对照组试验组ΔOD酶活/(U/mL)1234.60.1330.1590.1790.1560.0320.3405.00.2260.2660.2520.2630.0340.4935.40.8051.1121.1511.0880.31216.3385.80.3460.5810.5690.5600.22411.3166.20.3110.4740.5210.4850.1828.9386.60.5851.0341.1041.0870.49026.4967.00.5170.9080.9590.9270.41422.1787.40.6731.0271.0441.0610.37119.705由表10可知，滤纸酶在pH值为4.6时仍有活性，在pH值5.4时达到峰值（11.012 U/mL）；当pH值为5.8~6.6时，滤纸酶活降至4.639 U/mL；pH值为7.0时，滤纸酶活回升至7.360 U/mL，但仍低于pH值5.4时的酶活力。结果表明，滤纸酶的活性范围较广，且在强酸乃至弱碱条件下仍有酶活性。pH值是菌株生长过程中不可忽视的环境因素，影响菌种吸收营养物质和代谢过程中酶的活性[17]。因此，在本试验中纤维素酶的最适初始pH值为6.6，滤纸酶pH值5.4。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.01.017.T010表10不同pH值对滤纸酶活性的影响pH值对照组试验组ΔOD酶活/(U/mL)1234.60.4290.4810.5000.4620.0521.5015.00.4380.5460.5240.5620.1064.5825.41.9472.2121.9922.2930.21911.0125.80.8430.9820.9200.9950.1235.5346.20.8380.9210.9370.9750.1064.6016.60.8721.0130.8651.0590.1074.6397.00.8430.9760.9861.0310.1557.3607.40.7940.9250.9030.9490.1326.0472.6不同碳源对酶活性的影响（见表11、表12）由表11可知，不同营养物质作为碳源时均具有一定的纤维素酶活性，麦麸为底物时表现的活性较差；而在纤维二糖为底物时，其酶活力可达到31.822 U/mL；乳糖和淀粉酶活均大于25 U/mL。因此，纤维素酶对碳源的选择不唯一。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.01.017.T011表11不同碳源对纤维素酶活性的影响碳源对照组试验组ΔOD酶活/(U/mL)123蔗糖0.3390.3840.3710.3560.03116.414淀粉0.2290.2940.2440.2890.04725.164乳糖0.3660.3690.4170.4690.05228.398纤维二糖0.2930.3310.3530.3700.05831.822麦芽糖0.2850.3230.3170.3270.03719.838麦麸0.2540.3080.3090.3400.0659.661由表12可知，以淀粉为底物时，滤纸酶表现的活性最高为15.273 U/mL。因此，可溶性淀粉可能同为两种酶的适宜碳源。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.01.017.T012表12不同碳源对滤纸酶活性的影响碳源对照组试验组ΔOD酶活/(U/mL)123蔗糖0.3630.3910.3870.3920.02713.941淀粉0.3020.3310.3320.3310.02915.273乳糖0.5040.5330.5230.5230.02211.278纤维二糖0.3990.4160.4070.4270.0188.615麦芽糖0.3870.3870.4040.3940.0083.099麦麸0.3100.3370.3660.3780.0507.1503讨论芽孢杆菌是一类具有丰富的胞外酶系的产酶菌，可分泌多种消化酶，如纤维素-复合酶、半纤维素酶等[18]。贝莱斯芽孢杆菌是一种解淀粉芽孢杆菌后期异型体[19]，能够产生多种次级代谢产物。Verma等[20]研究表明，贝莱斯芽孢杆菌能够降解粗纤维，将纤维素降解为还原性糖。吴佳勇[21]从猪盲肠分离得到一株具有纤维素降解能力的贝莱斯芽孢杆菌株，利用此菌对玉米秸秆进行发酵后可降低纤维素含量，提高粗蛋白含量，从而提升猪的生产性能。吴长伟等[22]利用贝莱斯芽孢杆菌高效降解烟梗纤维素，以提高烟梗浸膏的品质。本试验探究从台湾乳白蚁肠道内筛选出的贝莱斯芽孢杆菌的最适产酶条件，结果表明，接种量为8%时，纤维素酶和滤纸酶活性最高，与陈龙等[23]的结果存在差异。本试验中未涉及这一接种量，但在4%接种量时酶活力仍然很弱。本试验中，贝莱斯芽孢杆菌的最适发酵时间为72 h，最适温度为45 ℃，与Paudel等[24]的结果一致。当温度达到65 ℃时，贝莱斯芽孢杆菌仍保持一定的纤维素酶活力，因此，该菌株在一定程度上可耐高温，适合在青贮饲料时使用。当初始环境pH值为6.6时，纤维素酶活最显著；而陈少先等[25]和孙会刚等[26]的研究结果显示，贝莱斯芽孢杆菌产纤维素酶的最适pH值为6，但均为弱酸偏中性。以纤维二糖作为碳源营养时，活性能够达到最大。本试验中未比较分别以羧甲基纤维素钠和纤维二糖为唯一碳源时产纤维素酶能力，但陈龙等[23]等研究表明，贝莱斯芽孢杆菌产纤维素酶具有底物专一性。因此，以羧甲基纤维素钠为唯一碳源时产酶能力更强。由此可知，不同来源的贝莱芽孢杆菌产纤维素酶所适宜的条件存在偏差。4结论本试验结果显示，接种量为8%时，纤维素酶和滤纸酶活性最高；当发酵时间为72 h，温度为45 ℃，环境pH值为6.6时纤维素酶活最显著；以纤维二糖作为碳源营养时，活性达最大值，为31.822 U/mL。滤纸酶活的最适接种量、发酵温度与纤维素酶活一致，但最适培养时间为48 h，最适酸碱环境pH值为5.4，最适碳源为淀粉，活力为15.273 U/mL。