中华绒螯蟹具有肉质鲜美、营养价值高等特点，是我国主要的养殖甲壳动物之一[1]。中华绒螯蟹自然资源逐步枯竭，其养殖模式由自然捕捞转向以养殖为主[2]。天然饵料不足，将加大对人工饵料的需求。我国水产动物营养研究与水产饵料工业起步较晚[3]，养殖品种众多，河蟹配合饵料与基础生物学的研究有待完善。糖类作为三大营养物质之一，在中华绒螯蟹生长发育繁殖过程中起重要作用。在配合饵料中添加适量的糖类能够促进动物的生长发育[4]，提高蛋白质利用率，降低饵料成本。饵料中添加糖水平为20%时，幼蟹增重率、成活率最高[5]。但饵料中糖水平过高可对中华绒螯蟹的生长产生负面影响[6]。配合饵料的成分影响甲壳动物的消化酶活力[7]。郭冉等[8]研究发现，玉米淀粉添加量为20％时，凡纳滨对虾消化率最高。Zainuddin等[9]研究发现，38％的玉米淀粉添加量可使凡纳滨对虾幼虾获得最佳的特定生长率和消化率。江星[10]研究发现，在饵料糖类质量分数为20％时，较适宜投喂中华绒螯蟹。王耀华等[11]研究发现，以16%淀粉水平饵料投喂中华绒螯蟹，其胰蛋白酶活力最高。董兰芳等[12]研究发现，高淀粉饵料组水平拟穴青蟹稚蟹淀粉酶活力显著高于低淀粉水平组。目前，有关甲壳动物消化酶最适温度和pH值的研究有角对虾[13]、加州对虾[14]、中国明对虾、日本对虾[15]、墨吉明对虾[16]、三疣梭子蟹[17]等，但关于中华绒螯蟹的消化酶最适温度和pH值未见报道。本试验以5种不同淀粉水平的饵料投喂中华绒螯蟹，测定中华绒螯蟹肠道和肝胰脏中淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶比活力，为中华绒螯蟹饵料中适宜淀粉的添加量提供参考。1材料与方法1.1试验动物幼蟹购自天津三缘宝地农业科技有限公司，于天津市水产研究所淡水站开展养殖试验。1.2试验设计及试验饵料试验开始前，中华绒螯蟹于36 m2水泥池暂养2 w，暂养结束挑选体格健壮、初始体重为（10.0±0.1）g的中华绒螯蟹300尾，随机分成5组，每组3个平行，每个平行20尾。以重复为单位饲养于15个水槽（55 cm×65 cm）中。试验期60 d。基础饵料组成及营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.01.013.T001表1基础饵料组成及营养水平（风干基础）项目12%淀粉组17%淀粉组22%淀粉组27%淀粉组32%淀粉组原料组成鱼粉32.1032.1032.1032.1032.10豆粕16.0016.0016.0016.0016.00小麦淀粉12.0017.0022.0027.0032.00微晶纤维素20.0015.0010.005.000.00酪蛋白6.906.906.906.906.90谷朊粉5.005.005.005.005.00鱼油2.002.002.002.002.00维生素预混料1.001.001.001.001.00矿物质预混料1.001.001.001.001.00瓜尔胶1.501.501.501.501.50磷酸二氢钙1.001.001.001.001.00卵磷脂1.001.001.001.001.00胆固醇0.500.500.500.500.50合计100.00100.00100.00100.00100.00营养水平水分7.808.108.308.008.20粗蛋白质35.7035.8035.3035.4035.70粗脂肪5.405.505.205.405.30粗灰分8.408.408.708.608.60注：1.每千克维生素预混料为饵料提供：硫胺素0.5 g、VB2 0.7 g、VB6 0.6 g、VB12 0.002 g、VK3 0.5 g、VA 450 000 IU、VD3 150 000 IU、VE 5 g、烟酸3.5 g、叶酸0.15 g、生物素0.060 g；每千克矿物质预混料为饵料提供：肌醇8 g、MgSO4·H2O 25 g、CuSO4·5H2O 2 g、FeSO4·H2O 2 g、ZnSO4·H2O 10 g、MnSO4·H2O 3 g、CoCl2·6H2O 0.08 g、Ca(IO3)2 0.1 g、Na2SeO3 0.01 g、维生素C酯28.57 g。2.营养水平均为实测值。%各原料粉碎，过60目筛，按照饵料配方称重加入适量水，采用双螺杆挤压膨化机制成直径为2 mm的不同淀粉水平颗粒饵料，55 ℃烘干，-20 ℃保存。各组分别投喂小麦淀粉水平为12.0%、17.0%、22.0%、27.0%、32.0%的配合饵料。1.3饲养管理试验期间每日投喂2次（9：00、17：00），投喂1 h后收集残饵，桶内去污，记录投喂量、死亡数等；试验采取循环水养殖模式，水流速度保持2 L/min，温度（26±1）℃，pH值为7.5±0.2，溶氧浓度大于5 mg/L，氨氮浓度小于0.05 mg/L。每周称重1次，根据实际摄食情况调整投喂量。1.4测定指标及方法样品采集：养殖试验结束后空腹24 h，挑选健康的中华绒螯蟹，去除水分后测量生长指标每组平行取15尾蟹，擦干，测量生长指标，取肝胰脏、肠道，-80 ℃保存。1.4.1消化酶活力最适温度和pH值称取1 g样品，按照1∶9比例加生理盐水稀释，研磨，4 ℃ 10 000 r/min离心30 min，取上清。采用南京建成生物公司生产的试剂盒测定匀浆液蛋白含量。蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶最适温度和pH值测定参考夏苏东[18]试验方法，设置5~65 ℃范围内，每5 ℃为1个温度梯度；设置pH值为1~12，每间隔1个pH值为1个梯度。蛋白酶pH值条件调节测定：37 ℃条件下，每分钟水解干酪素产生1 μg酪氨酸定义为1个酶活力单位（U），每毫克蛋白含有酶活力数定义为比活力（U/mg prot）。蛋白酶温度条件调节测定：不同温度条件下，每分钟水解干酪素产生1 μg酪氨酸定义为1个酶活力单位（U）,每毫克蛋白含有酶活力数定义为比活力（U/mg prot）。淀粉酶pH值条件调节测定：37 ℃条件下，每分钟催化淀粉产生1 μg麦芽糖作为1个酶活力单位（U），每毫克蛋白含有酶活力数定义为比活力（U/mg prot）。淀粉酶温度条件调节测定：不同温度条件下，每分钟催化淀粉产生1 μg麦芽糖作为1个酶活力单位（U），每毫克蛋白含有酶活力数定义为比活力（U/mg prot）。纤维素酶pH值条件测定：37 ℃条件下，每分钟催化甲基纤维素钠产生1 μg葡萄糖作为1个酶活力单位（U），每毫克蛋白含有酶活力数定义为比活力（U/mg prot）。纤维素酶温度条件调节测定：不同温度条件下，每分钟催化甲基纤维素钠产生1 μg葡萄糖作为1个酶比活力单位（U），每毫克蛋白含有酶活力数定义为比活力（U/mg prot）[19]。1.4.2不同淀粉水平饵料消化酶比活力测定蛋白酶比活力的测定参考Kunitz[20]方法。缓冲液调节pH值为6，以温度为55 ℃，每毫克蛋白每分钟水解干酪素产生1 μg酪氨酸定义为1个酶比活力单位（U/mg prot）。淀粉酶比活力测定参考张雪娇等[21]方法。缓冲液调节pH值为7，以温度为40 ℃条件下，每毫克蛋白每分钟催化淀粉产生1 μg麦芽糖作为1个酶比活力单位（U/mg prot）。纤维素酶比活力测定参考张晓丽等[22]的方法。以缓冲液调节pH值为5，以温度为65 ℃，每毫克蛋白每分钟催化纤维素产生1 μg麦芽糖作为1个酶比活力单位（U/mg prot）。1.5数据统计与分析数据采用SPSS 25.0软件进行单因素方差分析，Duncan's法进行多重比较。结果以“平均值±标准误”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1温度对中华绒螯蟹消化酶活力的影响2.1.1温度对中华绒螯蟹蛋白酶比活力的影响（见表2）由表2可知，温度为5~65 ℃时，随温度升高，肝胰脏蛋白酶比活力呈先显著上升后下降的趋势；温度为55 ℃时，肝胰脏蛋白酶比活力达最大值。温度为5~65 ℃时，随温度升高，肠道蛋白酶比活力呈先显著上升后下降的趋势；温度为55 ℃时，肠道蛋白酶比活力达最大值，60 ℃时出现回落。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.01.013.T002表2不同温度对中华绒螯蟹消化酶比活力的影响温度/℃肝胰脏肠道蛋白酶淀粉酶纤维素酶蛋白酶淀粉酶纤维素酶50.420.160.290.310.580.21100.920.830.340.420.510.23150.660.790.410.570.590.24201.251.500.430.790.630.25251.601.770.390.790.640.25302.022.000.391.000.780.25352.471.260.300.840.640.26402.732.150.331.000.560.25452.572.120.381.050.560.27502.902.290.381.160.530.28552.912.300.351.660.600.28602.821.680.381.240.080.28652.42—0.461.16—0.30注：“—”表示未检出。U/mg prot2.1.2温度对中华绒螯蟹淀粉酶比活力的影响（见表2）由表2可知，温度为5~65 ℃时，肝、胰脏淀粉酶活力随温度升高呈先上升后下降的趋势；温度为55 ℃时，肝胰脏中淀粉酶比活力最大；温度为60 ℃时，酶活力明显下降。温度为5~25 ℃时，肠道淀粉酶比活力变化不明显；温度为30 ℃时，淀粉酶比活力迅速提高并达到最大值；温度为35~50 ℃时，淀粉酶比活力随温度升高逐渐降低。2.1.3温度对中华绒螯蟹纤维素酶比活力的影响（见表2）由表2可知，温度为5~20 ℃时，肝胰脏纤维素酶活性随温度升高而增加；温度为65 ℃时，肝胰脏纤维素酶活性达到峰值，并在70 ℃时迅速回落。温度为5~70 ℃时，肠道纤维素酶活力随温度升高先升高后降低，温度为65 ℃时达到最大值。2.2pH值对中华绒螯蟹消化酶比活力的影响2.2.1pH值对中华绒螯蟹蛋白酶比活力的影响（见表3）由表3可知，pH值为6时，肝胰脏蛋白酶比活力迅速上升并达到最大值，随后酶活力随着pH值增加缓慢降低；pH值为9~11时，酶活力迅速下降。pH值为6时，肠道蛋白酶比活力最大。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.01.013.T003表3不同pH值对中华绒螯蟹消化酶比活力的影响pH值肝胰脏肠道蛋白酶淀粉酶纤维素酶蛋白酶淀粉酶纤维素酶10.270.370.171.640.060.0320.490.360.221.980.010.0830.380.380.231.710.030.1340.413.430.412.001.300.1851.373.840.462.433.520.1961.823.940.272.743.830.1571.683.810.272.213.840.1481.653.000.242.003.480.1791.682.990.221.773.380.16101.130.050.271.690.560.08110.860.050.171.630.080.08120.910.010.101.320.010.06U/mg prot2.2.2pH值对中华绒螯蟹淀粉酶比活力的影响（见表3）由表3可知，pH值为1~3时，肝胰脏淀粉酶活力缓慢上升；pH值为3~4时，淀粉酶比活力迅速增至3.43 U/mg prot；在pH值为6时，肝胰脏淀粉酶比活力达到最大峰值。肠道淀粉酶活力在pH值为7时达到最大值。pH值为10时，肝胰脏淀粉酶比活力迅速下降后趋于平缓。2.2.3pH值对中华绒螯蟹纤维素酶比活力的影响（见表3）由表3可知，肝胰脏纤维素酶在pH值为1~5时呈上升趋势，并在pH值为5时达到最大活力。肠道纤维素酶活力在pH值为5时达到最高值，为0.46 U/mg prot；至在pH值为7时降至0.27 U/mg prot；pH值为8~9时短暂升高；而后在pH值为10时，迅速回落并趋向平缓。2.3不同淀粉水平对中华绒螯蟹消化酶活性的影响（见表4）由表4可知，肝胰脏中蛋白酶、淀粉酶比活力均显著高于肠道（P0.05），肠道中纤维素酶比活力显著高于肝胰脏（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.01.013.T004表4饵料不同淀粉水平对中华绒螯蟹消化酶活性的影响组别蛋白酶淀粉酶纤维素酶肠道肝胰脏肠道肝胰脏肠道肝胰脏12%淀粉组1.01±0.32a2.44±0.29b20.7±0.26c2.91±0.12d0.25±0.04c0.08±0.00b17%淀粉组0.93±0.14a2.75±0.20a2.17±0.78b3.07±0.13cd0.24±0.01c0.11±0.02ab22%淀粉组0.63±0.14b2.33±0.15b2.29±1.31b3.17±0.12bc0.35±0.04b0.15±0.09ab27%淀粉组0.59±0.15b2.33±0.19b2.35±0.38a3.50±0.11a0.46±0.04a0.25±0.01a32%淀粉组0.45±0.07b2.00±0.15c2.26±0.33ab3.37±0.28ab0.45±0.03a0.32±0.11a注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）。U/mg prot2.3.1不同淀粉水平对中华绒螯蟹蛋白酶比活力的影响（见表4）由表4可知，12%、17%淀粉组肠道蛋白酶比活力显著高于其他3组（P0.05）；17%淀粉组肝胰脏蛋白酶比活力显著高于其他4组（P0.05），32%淀粉组肝胰脏蛋白酶比活力显著低于其他4组（P0.05）。2.3.2不同淀粉水平对中华绒螯蟹淀粉酶比活力的影响（见表4）由表4可知，12%淀粉组肠道淀粉酶比活力最低，显著低于其他4组（P0.05）；27%淀粉组肝胰脏淀粉酶比活力最高，显著高于除32%组以外的其他3组（P0.05）。2.3.3不同淀粉水平对中华绒螯蟹纤维素酶比活性影响（见表4）由表4可知，27%、32%淀粉组肠道纤维素酶比活力显著高于其他3组（P0.05）。12%淀粉组肝胰脏纤维素酶比活力最低，显著低于27%、32%淀粉组（P0.05），17%淀粉组和22%淀粉组与其他3组间无显著差异（P0.05）。3讨论影响甲壳动物消化酶活性的因素可分为内在因素（蜕皮周期和生长发育期等）与外在因素（温度、饵料等）[23]。饵料对中华绒螯蟹生长影响最大。中华绒螯蟹为变温动物，体温受外界环境影响较大；当外界环境发生变化时，蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶活性也会受到影响，进而影响中华绒螯蟹生长。3.1不同温度对中华绒螯蟹消化酶活性的影响本试验中，蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶活性均呈随温度升高先升后降的趋势，且在不同组织的最适温度不同，纤维素酶在肝脏胰、肠道中的最适温度65 ℃。研究报道，三疣梭子蟹肠道纤维素酶最适温度为65 ℃[17]，与本试验结果一致。本试验结果显示，中华绒螯蟹蛋白酶在肝脏和肠道最适温度为55 ℃，与胡毅等[17]研究中三疣梭子蟹蛋白酶和淀粉酶最适温度为55 ℃以及郭文浚等[16]研究墨吉明对虾蛋白酶最适温度为55 ℃的结果一致。加州对虾[14]、南美白对虾[15]的肠道淀粉酶最适温度与本试验结果一致，均为30 ℃。肝脏和肠道最适温度的差异可能与淀粉酶在不同组织中活性不同密切相关。3.2不同pH值对中华绒螯蟹消化酶活力的影响本试验结果显示，中华绒螯蟹肝胰脏、肠道纤维素酶最适pH值在5时达到最大值。胡毅等[17]研究发现，三疣梭子蟹最适pH值为4.8。徐慧萍等[24]研究发现，纤维素酶在草鱼肝脏pH值为4.8和6.4时。活性最大的结果类似。存在较小差异可能是由于物种不同，机体产生纤维素酶的种类及组成不完全相同，同时与食物种类、来源还与生存环境差异密不可分。甲壳动物消化酶对饵料组成确有适应作用，在消化酶与摄食之间存在一种补偿机制[25]。本试验结果显示，中华绒螯蟹肝胰脏、肠道蛋白酶最适pH值为6时出现峰值，肝胰脏、肠道淀粉酶在pH值为6和7时出现最大活性，与三疣梭子蟹蛋白酶、淀粉酶最适pH值范围为7~8、7.5[17]，墨吉明对虾蛋白酶、淀粉酶最适pH值为6的结果相近[16]。黄燕华等[26]研究发现，南美白对虾蛋白酶在肝胰脏和肠道中的最适pH值分别为6.0、7.5，淀粉酶在肝脏和肠道最适pH值分别为7.0、6.5，与本试验结果接近。以上结果出现细微差异主要可能为种类差异导致。3.3不同淀粉水平对中华绒螯蟹消化酶活力的影响饵料能量水平是影响生物摄食主要因素，而与能量相关的是糖类即消化吸收的淀粉的含量。在一些草食性和杂食性鱼类研究中发现，淀粉酶活力与饵料中糖水平呈正相关[27]。郭冉等[8]研究发现，随着饵料中玉米淀粉水平升高，凡纳滨对虾成活率与摄食率均下降。本试验结果显示，不同淀粉水平对中华绒螯蟹蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶均有显著影响，随着饵料淀粉水平增加，淀粉酶活力、纤维素酶比活力均呈升高趋势，蛋白酶活力呈下降趋势。董兰芳等[12]采用不同碳水化合物水平饵料对拟穴青蟹稚蟹进行研究，结果发现，高碳水化合物水平饵料组稚蟹的淀粉酶活性显著高于低碳水化合物水平饵料组。王耀华等[11]采用不同淀粉水平的饵料投喂中华绒螯蟹幼蟹，结果发现，幼蟹胰蛋白酶活力在16%淀粉组最高。董兰芳等[28]以拟穴青蟹仔蟹为试验对象，分别投喂不同糖脂比的等氮等能饵料，发现糖脂比显著影响蛋白酶和脂肪酶活性；随着饵料糖脂比增加，蛋白酶活性呈先增大后减小的趋势，与本试验结果相似。综上所述，最适淀粉水平出现差异的主要原因为淀粉种类差异。不同生物、不同糖源、不同糖水平均存在差异[29]。蛋白酶随淀粉水平先升高后降低，可能是因为在糖类物质充足条件下，中华绒螯蟹优先利用糖类物质。因此，淀粉酶活力随淀粉水平升高而增加，蛋白酶活力下降。纤维素酶活性随淀粉水平升高而升高，但纤维素酶是肠道微生物代谢产物还是由机体产生，此争议问题需深入探讨。4结论中华绒螯蟹肝胰脏和肠道中蛋白酶适温度均为55 ℃，肝胰脏和肠道中蛋白酶最适pH值均为6。肝胰脏和肠道中淀粉酶最适温度分别为55、30 ℃，最适pH值分别为6、7。肝、胰脏和肠道纤维素酶最适温度均为65 ℃，最适pH值均为5。不同淀粉水平饵料可对中华绒螯蟹消化酶产生显著影响，中华绒螯蟹通过调节消化酶活力适应饵料组分的变化。