动物饲料中抗生素添加剂的不规范使用，使食品安全、环境污染等方面产生诸多问题。与抗生素相比，酸化剂不会产生耐药性[1]，可作为绿色饲料添加剂应用于动物养殖业中。程远之等[2]发现，基础饲料中添加0.2%乳酸型酸化剂，可显著提升断奶仔猪的血清IgA含量，同时仔猪十二指肠中与免疫相关的TGF-β mRNA和IL-10 mRNA相对表达量也得到显著提升。Canibe等[3]通过试验证明，酸性条件可以促进乳酸菌的生长繁殖，抑制大肠杆菌等有害微生物的繁殖。张军等[4]研究表明，柠檬酸、乙酸等有机酸均利于重金属Cd的二价离子转变为交换态，并在一定范围内随浓度的增加解毒效果增强。近年来，关于酸化剂的研究报道较多，但缺乏统一的评价指标，导致产品的质量参差不齐。延胡索酸、乳酸、一水柠檬酸是复合酸化剂中的常见有机酸，在饲料中添加具有降低肠道pH值，抑制肠道致病菌生长，提高养分吸收率等多种作用[5]。甲酸钙是一种小分子有机酸甲酸的钙盐，进入动物体内后可解离出甲酸，由于甲酸酸性大于碳酸，可与消化道中的碳酸盐中和，可达到降低消化道pH值的目的。本研究通过响应面设计法对复合酸化剂的配方进行优化，针对不同的指标建立不同的优化方法，为实际生产提供参考。1材料与方法1.1试验材料延胡索酸、一水柠檬酸购自国药集团化学试剂有限公司；乳酸购自天津市恒兴化学试剂制造有限公司；甲酸钙、气相二氧化硅载体购自上海麦克林生化科技有限公司；MH培养基粉末、琼脂粉末购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；PHS-3C酸度测定仪购自上海佑科仪器仪表有限公司；磁力搅拌器购自上海仪昕科学仪器有限公司；20~200 μL移液枪购自湖南力辰仪器科技有限公司；90 mm玻璃培养皿购自上海晶安生物科技有限公司。1.2试验设计本试验以延胡索酸、乳酸、一水柠檬酸、甲酸钙4个因子为自变量，采用响应面法中的Box-Behnken模型进行快速优化。设计选取各配方2%水溶液缓冲力（Y1）、系酸力改变量（Y2）、10%水溶液对大肠杆菌的抑菌圈直径（Y3）、10%水溶液对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径（Y4）为响应值。响应面试验因素水平设计见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.01.014.T001表1响应面试验因素水平设计水平A延胡索酸B乳酸C一水柠檬酸D甲酸钙-11.02510105.535153110.045205%1.3测定指标及方法1.3.1各酸化剂配方2%水溶液缓冲能准确称取2.0 g各配方酸化剂，加至98.0 g去离子水中，制备成各配方2%水溶液，加热，保持37 ℃模拟动物体内环境。将pH计的电极探头固定在溶液中，向水溶液中滴加1 mol/L的NaOH溶液，滴定终点为该水溶液pH值改变一个整数单位，记录NaOH溶液的消耗量（mL），测酸化剂2%水溶液缓冲能力。各配方酸化剂测量3个平行，取平均值。1.3.2各酸化剂配方在日粮中2%添加量的系酸力改变量系酸力即酸结合力是指将100 g饲料溶于200 mL去离子水中，使用1 mol/L的盐酸进行滴定，使pH值为4时所消耗的盐酸毫升数[6]。系酸力越强，饲料越显碱性，使胃蛋白酶原无法被激活和有效释放，降低畜禽对于饲料蛋白质和碳水化合物等的消化吸收，也会加速病原菌繁殖[7]。因此，一种能够降低系酸力的酸化剂对基础饲料尤为重要。在烧杯中称取100 g未加酸化剂的市售常规仔猪日粮，加入200 mL去离子水，使用磁力搅拌器搅拌至形成浆状液，将pH计的电极探头插入浆状液中，滴加1 mol/L的盐酸溶液，滴定终点为pH值达到4.0，记录所消耗HCl的量（mL），测得日粮的基础系酸力（A0）。将各配方酸化剂准确称取2.0 g，加入98.0 g上述市售常规仔猪日粮中，加400 mL去离子水，使用磁力搅拌器搅拌均匀至形成浆状液，加热，保持37 ℃模拟动物体内环境。将pH计电极探头插入浆状液中，记录pH值，向其中滴加1 mol/L的HCl溶液，滴定终点为浆状液pH值至4.0，并稳定60 s，记录HCl消耗量（mL），即测得日粮系酸力（A1）。各配方酸化剂测量3个平行，取平均值。计算日粮中2%酸化剂添加量的系酸力改变量。ΔA=A0-A1 (1)1.3.3各酸化剂配方对大肠杆菌抑菌能力的测定大肠杆菌（菌株编号CICC21482）购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。将复合酸化剂按照试验配方配制成10%的水溶液。分别取培养好大肠杆菌的培养皿各1个，每个平板在相同位置放置2个牛津杯。将各酸样品取相同体积（100 μL）加入牛津杯中，培养24 h，观察抑菌效果并测量牛津杯周围产生的抑菌圈的直径。1.3.4各酸化剂配方对金黄色葡萄球菌抑菌能力的测定金黄色葡萄球菌（菌株编号ATCC6538P）购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。试验方法同1.3.3。1.4数据统计与分析数据采用Microsoft Excel进行初步的统计与整理，建模回归分析采用Design-Expert 8.0.6中的Box-Behnken功能进行。P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1各酸化剂配方试验设计与结果各配方响应值2%水溶液缓冲力（Y1）、系酸力改变量（Y2）和两种细菌的抑菌圈直径（Y3、Y4）的试验设计与结果见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.01.014.T002表2试验设计与结果试验号ABCDY1Y2Y3/mmY4/mm1010-14.509.1814.5110.79200004.077.6416.4814.76310015.1610.3117.3113.13400004.087.6116.2414.855001-13.698.8314.6814.516100-13.937.5011.9515.4370-10-13.345.6413.4412.38801015.347.5516.5416.80900114.788.8014.7615.0810-1-1003.175.1813.4112.0011-10104.027.2413.2214.011200004.077.6516.1714.77130-1014.335.7211.8314.6114-100-12.965.7813.9411.061500004.077.6416.7814.56161-1004.246.0316.7514.001700-114.317.0713.1311.971800-1-13.296.6717.2616.611900004.077.6616.3514.332001104.7610.2314.5913.602101-104.428.0816.2213.0922-10-103.385.6812.0014.672310105.109.7917.6812.912410-104.476.9612.8612.5025-10014.316.0111.9011.90260-1103.826.1312.5513.5327-11004.236.2616.6110.69280-1-103.485.6414.5815.602911005.117.8913.5315.412.24个响应值的回归分析通过Design-Expert 8.0.6软件对所得数据进行回归分析，4个自变量经过拟合，根据实际值得到的回归方程见表3。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.01.014.T003表3酸化剂回归分析结果项目回归方程R2P值缓冲力Y1=+0.229 67+0.086 296A+0.056 417B+0.043 833C+0.271 67D0.816 50.000 1系酸力改变量Y2=-1.024 82+0.223 70X1+0.140 67X2+0.136 00X3+0.077 500X40.645 90.000 1大肠杆菌抑菌圈直径Y3=+21.134 28+0.198 33A+0.108 33B-0.581 92C-4.314 72D-0.035 667AB+0.040 00AC+0.205 56AD+0.020 0BC+0.045 500BD+0.105 25CD0.496 90.138 4金黄色葡萄球菌抑菌圈直径Y4=+33.270 13-0.277 96A-0.432 86B-0.920 97C-0.314 86D+0.151 11AB+0.118 89AB-0.872 22AD+0.012 9BC+0.047 250BD+0.013 01CD0.325 60.576 0由表3可知，响应值Y1和Y2可通过线性模型进行拟合，对两个响应值建立的模型的决定系数R2值分别为0.950 3和0.720 0，说明线性模型对缓冲力和系酸力改变量随前文所述4个自变量变化的趋势的拟合度较好。响应值Y3和Y4用2FI模型得到的回归方程的P值均大于0.05，说明拟合的显著性较差，在经过其他模型的回归分析后，虽然有部分达到了P0.05，但会导致最小二乘参数不唯一，故而不可作为Y3和Y4这两个响应值的回归模型。因此，大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径不是筛选酸化剂的合适指标。2.3可能对缓冲力、系酸力产生影响的因素分析各配方2%水溶液缓冲力Y1和系酸力改变量Y2的回归模型方差分析结果见表4、表5。由表4可知，方程Y1中A、B、C和D对响应值Y1影响均显著（P0.05）。因此，选用Y1回归模型：Y1=+0.229 67+0.086 296A+0.056 417B+0.043 833C+0.271 67D（R2=0.816 5，P0.000 1）。因此，延胡索酸、乳酸、柠檬酸和甲酸钙对缓冲力均有正调节作用，影响力排序为：甲酸钙延胡索酸乳酸柠檬酸。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.01.014.T004表4缓冲力回归模型方差分析项目平方和自由度均方F值P值模型9.7542.4426.690.000 1A1.8111.8119.820.000 2B3.8213.8241.830.000 1C0.5810.586.310.019 1D3.5413.5438.800.000 1残差2.19240.091总误差11.942810.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.01.014.T005表5系酸力回归模型方差分析项目平方和自由度均方F值P值模型41.74410.4415.430.0001A12.16112.1618.950.0015B23.74123.7427.480.0001C5.5515.5514.860.0239D0.2910.290.430.5879残差22.88241.14总误差64.6328由表5可知，方程Y2中A、B和C对响应值Y2的影响达显著水平（P0.05），而D对响应值Y2的影响不显著（P0.05）。对方程进行逐步回归后，优化得到新的回归模型：Y2=-0.792+0.224A+0.141B+0.136C（R2=0.598，P=0.559）。新的模型与Y2相比，决定系数相差不大，而显著性相差极大，故而采用原方程：Y2=-1.024 82+0.223 70A+0.140 67B+0.136 00C+0.077 500D。由回归方程可知，延胡索酸、乳酸、柠檬酸和甲酸钙对系酸力改变量均有正调节作用，影响力排序为：延胡索酸乳酸一水柠檬酸甲酸钙。根据试验设计以及实际生产中的需要，一种理想的复合酸化剂的缓冲力和系酸力改变量应尽可能高，因此对上述建立的回归模型取最大值。运用Design-Expert 8.0.6软件中的Optimization功能，则当以2%水溶液缓冲力达到最大值为条件时，最佳配方为延胡索酸7.57%、乳酸44.27%、一水柠檬酸16.26%和甲酸钙4.71%，此时2%水溶液缓冲能力为5.37；当以2%水溶液的系酸力改变量达到最大值为条件时，最佳配方为延胡索酸9.88%、乳酸44.96%、一水柠檬酸20.00%和甲酸钙1.43%，此时2%水溶液对饲料的系酸力改变量为10.34；当缓冲力和系酸力同时达到最大值时，酸化剂最佳的配方为延胡索酸9.14%、乳酸44.62%、一水柠檬酸19.87%、甲酸钙4.59%，此时缓冲力为5.65，系酸力为10.35。3讨论湛穗璋等[8]研究发现，缓冲能力和系酸力改变量为体外评价酸化剂配方的两项有效指标，而酸化剂对大肠杆菌的抑菌能力不应作为响应面法中优化酸化剂配方的指标。秦圣涛[9]认为，缓冲能力、系酸力改变量和对大肠杆菌的抑制能力是体外评价酸化剂的有效指标。本试验中，选用缓冲能力、系酸力改变量、大肠杆菌以及金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径4项指标对复合酸化剂配方进行筛选和优化，试验中建立的回归方程前两个指标均达显著水平，且对两个响应值建立的模型的R2值分别为0.816 5和0.645 9，说明本试验选取缓冲力和系酸力改变力两个指标对其回归方程有较强的解释性。有机酸抑菌作用的分子机制非常复杂，可能是多机制协同作用。近中性或偏碱性的有机酸盐具有和有机酸相似的抑菌效果。唐湘方等[10]研究发现，甲酸钙（pH值呈中性）和甲酸对肠道中的大肠杆菌、肠球菌和拟杆菌抑菌活性相似。相同pH值环境下，不同有机酸抑菌活性有很大差异。pH值4.0时，对大肠杆菌E. coil抑菌活性甲酸是乳酸的4倍[11]。本研究中，可能是由于复合酸化剂的抑菌活性与其pH值相关性不强，导致大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径拟合的显著性较差，因此不适合作为复合酸化剂的筛选指标。酸化剂中的酸与强酸钠盐耦合更有利于日粮系酸力和电解质平衡的调控[12]。李鹏[13]研究发现，乳酸是以乳酸、柠檬酸和延胡索酸为主成分的乳酸型酸化剂中影响系酸力的主要组分；而磷酸是以磷酸、柠檬酸、延胡索酸和甲酸钙为主的磷酸型酸化剂中影响系酸力的主要组分。本试验选取大分子有机酸与小分子有机酸盐相结合，大分子有机酸解离速度较慢，作用时间更持久，能够作为中间产物参与动物三羧酸循环等生理过程。通过响应面法对复合酸化剂进行优化是可行的，且当酸化剂效果评价指标不同时结果不同；配方不同的复合酸化剂，起到的作用和达到的效果也都不尽相同。4结论当复合酸化剂中延胡索酸占7.57%、乳酸占44.27%、一水柠檬酸占16.26%、甲酸钙占4.71%时，2%水溶液缓冲能力最大，为5.37；当复合酸化剂中当延胡索酸占9.88%、乳酸占44.96%、一水柠檬酸占20.00%、甲酸钙占1.43%时，2%水溶液对饲料的系酸力改变量最大，为10.34；当两者同时达到最大时，延胡索酸9.14%、乳酸44.62%、一水柠檬酸19.87%、甲酸钙4.59%，此时缓冲力为5.65，系酸力为10.35。通过响应面法可对酸化剂配方进行快速优化，达到了预期目的且当酸化剂效果的评价指标不同时所得结果不同。大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径可能不适合作为本试验中复合酸化剂的筛选标准。