洋槐花又称刺槐，在黄河、淮河流域广泛培育[1]。随着病理学研究不断深入，洋槐花的药用价值逐步被发掘[2]。洋槐花皂苷具有抑菌、抗氧化作用[3]，能够促进奶牛增重、提高产乳量、治疗蛋鸡肠毒综合征等[4]，可以作为饲料添加剂在畜禽养殖中应用。罗宽等[5]研究发现，日粮中添加苜蓿皂苷可提高蛋鸡的生产性能，改善血清生化指标。王勇等[6]研究发现，苜蓿皂苷显著提高了肉牛的生长和瘤胃发酵性能与营养物质表观消化率。张向杰等[7]研究发现，添加油茶皂苷能够提高蛋种鸡的鸡蛋品质，减少破蛋与沙皮畸形蛋。杨玉增等[8]研究表明，在日粮中添加丝兰皂苷能够提高育肥猪的生长性能，改善舍内空气质量。洋槐花皂苷是苷元为三萜糖苷或螺旋甾烷的糖苷，化学结构复杂，溶于水、甲醇和稀乙醇，表面活性强。皂苷溶液可产生大量不易破裂的泡沫[9-11]，能够同香草醛的酸性体系溶液发生颜色反应。目前，关于洋槐花总皂苷的研究多集中于种植和营养价值，有关洋槐花皂苷提取与作为饲料添加剂的研究报道较少。本研究通过提取洋槐花总皂苷并分析其抗氧化活性，为洋槐花皂苷的进一步开发应用提供参考。1材料与方法1.1材料、试剂与设备试验材料：洋槐花采自运城市盐湖区；人参皂苷Re标准品（纯度99%）购自北京索莱宝生物科技有限公司。试验试剂：无水乙醇、石油醚、甲醇购自天津市恒兴化学试剂制造有限公司；正丁醇、香草醛、浓硫酸、DPPH试剂、抗坏血酸（VC）、FeSO4、H2O2、水杨酸、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、邻苯三酚、ABTS、过硫化钾，购自范德（北京）生物科技有限责任公司。试验设备：DGS280酶标仪（宁波久兴器械有限公司）、BGZ-146电热鼓风干燥箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）、RE-5298旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）。1.2试验方法1.2.1总皂苷提取选用新鲜的洋槐花，除杂，鼓风干燥机低温干燥制粉，干燥避光保存。取洋槐花粉1.00 g，加入乙醇溶液，超声后离心，取上清液[12]。1.2.2总皂苷测定选用人参皂苷Re标准品，制备0.1 g/L溶液作为对照品储备液，溶剂采用溶液。吸取1.0 mL对照品储备液，加入5%香草醛-乙醇溶液1 mL、77%浓硫酸8 mL，摇匀，60 ℃水浴20 min，0 ℃水浴10 min，室温60 min。试剂做空白对照。450~700 nm处测定吸光度，可测得最大吸光度为550 nm。绘制标准回归曲线方程为Y=4.409 7C+0.207（R2=0.999），测定洋槐花总皂苷提取率。洋槐花总皂苷提取率=C×V/(M×1 000)×100%(1)式中：C为洋槐花样品溶液中总皂苷含量（g/L）；V为样品溶液的总体积（mL）；M为洋槐花质量（g）。1.2.3单因素试验1.2.3.1液料比对提取率的影响选择提取洋槐花总皂苷液料比分别为10、15、20、25、30 mL/g。乙醇体积分数70%、提取温度50 ℃、提取时间40 min、超声频率80 W，得到最优液料比。1.2.3.2超声频率对提取率的影响固定料液比，超声频率分别为60、70、80、90、100 W，得到最优超声频率。1.2.3.3乙醇体积分数对提取率的影响固定超声频率，提取洋槐花总皂苷时乙醇体积分数为50、60、70、80、90%，得到最优乙醇体积分数。1.2.3.4提取时间对提取率的影响固定乙醇体积分数，提取洋槐花总皂苷时提取时间为20、30、40、50、60 min，得到最优提取时间。1.2.3.5提取温度对提取率的影响固定提取时间，提取洋槐花总皂苷提取温度为40、45、50、55、60 ℃，得到最优提取温度。1.2.4响应面试验设计结合单因素的试验结果，采用Box-Behnken模型[13]，以液料比A、超声频率B、提取时间C为因素，提取率Y为响应值，进行3因素3水平的响应面优化试验，响应面试验因素水平见表1，优化洋槐花总皂苷提取率。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.01.018.T001表1响应面试验因素水平水平因素A液料比/(mL/g)B超声频率/WC提取时间/min1157020220803032590401.3洋槐花总皂苷抗氧化能力测定1.3.1提纯采用石油醚、水饱和正丁醇超声波辅助，将上清液反复萃取至无色[14]，转入分液漏斗分液，旋转蒸发仪蒸发浓缩，转至鼓风干燥箱充分蒸干，低温烘干即得洋槐花总皂苷粉末。1.3.2DPPH自由基的清除率测定参考黄煦杰等[15]方法改进。制备1、2、3、4、5 g/L洋槐花总皂苷样液，甲醇溶解。取样液各1 mL，加入0.1 nmol/L DPPH试剂3 mL，摇匀后静置30 min，517 nm处测吸光度A1；加入蒸馏水3 mL，测定吸光度A2；无水乙醇代洋槐花总皂苷替样品溶液1 mL，测空白对照A0；无水乙醇为对照，阳性对照采用VC。清除率=[1-(A1-A2)/A0]×100%(2)1.3.3羟自由基的清除率测定参考邓晓梅[16]方法改进。制备1、2、3、4、5 g/L洋槐花总皂苷样液，甲醇溶解。取样液各1 mL，均加入9 mmol/L硫酸亚铁溶液3 mL、6 mmol/L过氧化氢溶液3 mL、9 mmol/L水杨酸乙醇溶液3 mL，37 ℃水浴60 min，测吸光度A1；蒸馏水代替试剂测吸光度A2；蒸馏水测空白对照吸光度A0；阳性对照采用VC。1.3.4超氧阴离子的清除率测定参考暴玮等[17]方法改进。制备1、2、3、4、5 g/L洋槐花总皂苷样液，甲醇溶解。取样液各1 mL，均加入Tris-HCl缓冲液（pH值8.2，50 mmol/L）4.4 mL，25 ℃水浴20 min，加入2.5 mmol/L 25 ℃水浴的邻苯三酚5.5 mL，25 ℃水浴4 min，2滴10.0 mmol/L HCl溶液止停，325 nm处测吸光度A1；去离子水代替试剂测吸光度A2；去离子水测空白对照吸光度A0。阳性对照采用VC。1.3.5清除ABTS＋自由基效果的测定参考林国荣等[18]方法改进。制备1、2、3、4、5 g/L洋槐花总皂苷样液，甲醇溶解。取样液各1 mL，均加入ABTS＋自由基工作液4 mL，6 min后在734 nm测试验组洋槐花总皂苷溶液吸光度A1。阳性组为1 mL质量浓度相同的抗坏血酸，测吸光度A2。对照组为1 mL蒸馏水，测吸光度A0。2结果与分析2.1单因素试验2.1.1液料比对洋槐花总皂苷提取率的影响（见图1）由图1可知，液料比为20 mL/g时，提取率最大为16.09%，进一步提高液料比，洋槐花总皂苷提取率降低。原因可能是乙醇溶液体积增加，使洋槐花粉末与乙醇溶液的接触时的面积增加，利于洋槐花中总皂苷的溶解，进而提高皂苷的溶解速率和提取率；若进一步增加溶剂体积，总皂苷在后续浓缩中损失增大。因此，最佳液料比为20 mL/g。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.01.018.F001图1液料比对洋槐花总皂苷提取率的影响2.1.2超声频率对洋槐花总皂苷提取率的影响（见图2）由图2可知，超声频率为80 W时，洋槐花总皂苷的提取率最高，达16.07%。超声频率继续增加反而降低洋槐花总皂苷的提取率，主要是超声波产生的辐射压细胞组织变形，植物蛋白质变性以及活性组分结构破坏或分解造成的。因此，80 W为最佳超声频率。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.01.018.F002图2超声频率对洋槐花总皂苷提取率的影响2.1.3乙醇体积分数对洋槐花总皂苷提取率的影响（见图3）由图3可知，乙醇体积分数为80%，提取率最大为16.17%。但之后乙醇体积分数越高，皂苷含量越低。乙醇浓度增加，蛋白质、糖等杂质的溶解量增加，与皂苷竞争乙醇，导致洋槐花总皂苷的提取率不升反降。因此，80%乙醇为最佳提取浓度。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.01.018.F003图3乙醇体积分数对洋槐花总皂苷提取率的影响2.1.4提取时间对洋槐花总皂苷提取率的影响（见图4）由图4可知，随着超声时间延长，洋槐花总皂苷的提取率呈先升后降。超声波作用30 min，总皂苷的提取率最高，为17.75%；超声时间继续增加，洋槐花总皂苷提取率稍有下降。随着提取时间的增加，洋槐花中的蛋白质和多糖等水溶性杂质溶出量增多，包裹洋槐花总皂苷分子，阻止洋槐花总皂苷向溶液中扩散，导致洋槐花总皂苷提取率降低；且超声时间过长，还会增加能源消耗。因此，30 min为提取洋槐花总皂苷的最佳提取时间。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.01.018.F004图4提取时间对洋槐花总皂苷提取率的影响2.1.5提取温度对洋槐花总皂苷提取率的影响（见图5）由图5可知，温度50 ℃时，洋槐花总皂苷提取率最高，为17.75%。温度过高，槐花中活性成分被破坏，溶出的杂质增多，降低了槐花中总皂苷的提取率。本试验中，最佳提取时间为50 ℃。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.01.018.F005图5提取温度对洋槐花总皂苷提取率的影响2.2响应面试验结果与分析2.2.1响应面试验结果（见表2、表3）利用Design-Expert 8.0建立试验设计[19]。利用Box-Behnken 8.7.6软件对分析结果进行多元回归拟合，得到方程为Y=17.74+0.035A-0.081B-0.11C-0.078AB+0.11AC-0.01BC-3.30A2-2.69B2-1.75C2。由表2、表3可知，模型的P0.000 1，响应面的回归方程达极显著水平。失拟项的P值是0.884 0大于0.05，说明回归模型具有非常优秀的模拟程度。模型的修正系数R2为0.998 0，R2adj为0.997 0，可得模型与试验数据吻合较好，可应用于后期预测试验结果。由P值可知影响提取率大小的顺序是：CBA。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.01.018.T002表2响应面试验设计及结果分析试验号A/(mL/g)B/WC/minY总皂苷提取率/%115703011.73225703011.95315903011.71425903011.62515802012.87625802012.73715804012.44825804012.73920702013.481020902013.351120704013.271220904013.101320803017.741420803017.781520803017.751620803017.721720803017.7110.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.01.018.T003表3回归方程方差分析项目平方和自由度均方F值P值显著性模型99.010 0911.000 022 159.950.000 1**A0.009 810.009 819.740.003 0**B0.053 010.053 0106.380.000 1**C0.099 010.099 0199.450.000 1**AB0.024 010.024 048.400.000 2**AC0.046 010.046 093.120.000 1**BC0.000 410.000 40.810.399 2A245.780 0145.780 092 225.120.000 1**B230.470 0130.470 061 373.960.000 1**C212.890 0112.890 025 975.010.000 1**残差0.003 470.000 5失拟项0.000 430.000 20.210.884 0不显著净误差0.003 040.000 7总和99.010 016注：*表示影响显著（P0.05），**表示影响极显著（P0.01）。2.2.2响应面分析（见图6）由图6可知，提取时间影响最显著，超声频率和料液比次之，结合等高线图与P值可知AB、AC、BC交互作用显著性关系为：ACABBC。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.01.018.F006图6各个因素两两交互作用对总皂苷提取率的影响试验结果优化得液料比20.026 mL/g、超声频率79.854 W、提取时间29.685 min为最佳提取条件参数。为减少实际操作中的误差，将实际操作中的局限性考虑在内，最佳配比参数修正为液料比20 mL/g、超声频率80 W、提取时间30 min。2.2.3最佳工艺条件的验证对获得的最佳配方进行验证测试，且平行进行3次试验。结果表明，按最佳提取条件的洋槐花总皂苷提取率为17.740%，与响应面理论值17.742%接近。此条件下，洋槐花总皂苷提取率高，试验消耗少，操作简便，为最佳提取条件。2.3洋槐花总皂苷抗氧化能力结果分析2.3.1洋槐花总皂苷对DPPH自由基的清除作用（见图7）由图7可知，槐花中总皂苷的含量增加至3 g/L，清除率变化大；清除能力增加至5 g/L，清变化幅度较小，67.93%为最大清除率，洋槐花总皂苷浓度为5 g/L。VC清除DPPH自由基能力不断增强。当浓度为1~3 g/L时，清除率变化较大；当浓度为3~5 g/L时，清除能力变化较小，与洋槐花总皂苷的清除能力变化趋势相同，但总体清除能力高于槐花总皂苷，清除率最高为82.43%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.01.018.F007图7洋槐花总皂苷对DPPH自由基的清除作用2.3.2洋槐花总皂苷对羟自由基的清除作用（见图8）由图8可知，试验范围内洋槐花总皂苷浓度增加时，清除羟自由基的能力越来越强。结果表明，槐花中总皂苷的含量增加至3 g/L，清除能力增加至4 g/L急剧增强，洋槐花总皂苷浓度在4~5 g/L范围内浓度趋于平稳，最高清除率为82.92%。VC的清除能力高于总皂苷，最高清除率高达87.32%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.01.018.F008图8洋槐花总皂苷对羟自由基的清除作用2.3.3洋槐花总皂苷对超氧阴离子的清除作用（见图9）由图9可知，试验范围内洋槐花总皂苷清除超氧阴离子的能力随浓度的增加而增强。但整体对超氧阴离子的清除能力不强，最高清除率为29.19%。VC的清除能力随浓度增加的变化不大，其清除能力强于洋槐花总皂苷，最高清除率达95.47%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.01.018.F009图9洋槐花总皂苷对超氧阴离子的清除作用2.3.4洋槐花总皂苷对ABTS＋自由基的清除作用（见图10）由图10可知，试验范围内洋槐花总皂苷浓度增加时，清除ABTS＋自由基的能力增强。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.01.018.F010图10洋槐花总皂苷对ABTS＋自由基的清除作用结果表明，清除ABTS＋自由基的能力在1~3 g/L范围内变化明显；3~4 g/L范围内趋于平缓，最高清除率为86.11%。3 g/L后VC对ABTS＋自由基的清除能力趋于平缓，最高清除率为89.45%。3结论洋槐花总皂苷提取的最佳提取条件为液料比20 mL/g、超声频率80 W、乙醇体积分数80%、提取时间30 min、提取温度50 ℃，此条件可得最大提取率为17.740%；洋槐花总皂苷浓度为5 g/L时，ABTS＋自由基的清除率最高，羟自由基的清除率可达82.92%；清除DPPH自由基的清除率为67.93%，超氧阴离子的清除率为29.19%。