断奶应激可引起肉兔肠道黏膜受损、免疫力下降、消化酶活性降低等问题，导致肉兔腹泻频发，养殖业损失惨重。腹泻病的传统防控方法为在饲料或饮水中添加抗生素，但随饲料禁抗全面实施，替抗品的研发迫在眉睫。合生素是益生菌与益生元配伍制成的生物制剂，可有效发挥益生菌和益生元的双重作用，对提高动物生产性能和养殖效益、保障畜产品安全意义重大。枯草芽孢杆菌制剂无毒、无害、无残留，是一种优质、高效、绿色环保的新型饲料添加剂。研究表明，兔料中添加一定剂量的枯草芽孢杆菌制剂可显著提高兔的生产性能和免疫力，改善屠宰性能和肉品质[1-3]。凝结芽孢杆菌抗逆性强、稳定性好、耐高温高压、产酶丰富，具有乳酸菌类制剂的产乳酸特性，可降低肉兔健康风险指数，提高饲料利用率[4]，改善肠道健康[5]。低聚木糖无毒、无残留、稳定性强，作为功能性低聚糖，具有维护肠道菌群平衡，提高免疫机能等功能。研究表明，低聚木糖可降低长毛兔的腹泻率[6]，促进獭兔小肠上皮细胞对葡萄糖和L-赖氨酸的吸收[7]，降低盲肠内容物pH值，提高微生物脱氢酶总活力[8]。但枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌与低聚木糖的联合应用的相关研究较少。本试验将前期筛选的抗菌活性较好的枯草芽孢杆菌制剂和凝结芽孢杆菌制剂1∶1混合，与低聚木糖2∶1比例配伍，混匀制成兔专用合生素，按0.02%、0.04%、0.06%比例添加至断奶肉兔基础日粮，研究合生素对肉兔生产性能、肠道生理健康及机体免疫力的影响，为合生素在肉兔生产中的推广应用提供参考。1材料与方法1.1试验地点试验于山东青岛康大兔业发展有限公司进行。1.2试验设计选用160只35日龄断奶新西兰肉兔，随机分为4组，每组5个重复，每个重复8只兔（公、母各半）。合生素低剂量组、中剂量组和高剂量组试验兔分别饲喂添加0.02%、0.04%、0.06%合生素的日粮，对照组肉兔饲喂基础日粮。每天8：00、17：00投喂日粮，投料量以肉兔充分吃饱而几乎不留日粮为准。预试期3 d，正式试验期42 d。肉兔免疫程序及其他饲养管理按兔场常规管理进行。基础日粮组成及营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.01.028.T001表1基础日粮组成及营养水平原料组成含量/%营养水平合计100玉米粉20消化能/(MJ/kg)10.50大豆粕17粗蛋白/%16.32苜蓿草粉15粗纤维/%15.22豆秸粉8钙/%1.25青蒿粉12总磷/%0.53麦芽根5蛋氨酸/%0.82大蒜皮10蛋氨酸+胱氨酸/%0.63复合预混料4葡萄糖2次粉7注：1.预混料为每千克基础日粮提供：铁100 mg、铜20 mg、锌90 mg、锰30 mg、硒0.15 mg、钴0.2 mg、VA 4 000 IU、VD3 1 000 IU、VE 50 mg、VK 2.25 mg、胆碱1 mg、D-泛酸15 mg、叶酸1.2 mg、地克珠利1 mg。2.营养水平均为实测值。1.3测定指标及方法1.3.1生产性能平均日增重(ADG)=总增重/(每组兔数×试验天数) (1)平均日采食量(ADFI)=(总投料量-总剩料量)/(每组兔数×试验天数)(2)料重比(F/G)=平均日采食量/平均日增重(3)腹泻率＝(腹泻兔数/每组试验兔数)×100%(4)成活率＝(成活兔数/每组试验兔数)×100%(5)1.3.2血清免疫指标试验结束每组随机挑选10只试验肉兔，心脏采血5 mL，室温静置30 min，离心分离血清。一份血清采用罗氏C311全自动生化分析仪检测血清总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）含量；另一份血清采用上海酶联生物科技有限公司生产的兔免疫球蛋白ELISA检测试剂盒检测血清免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白G（IgG）和免疫球蛋白M（IgM）的含量。1.3.3肠道形态观察试验结束每组随机屠宰10只试验肉兔，十二指肠、空肠、回肠上剪取2~3 cm肠管，冲净内容物，10%甲醛固定液固定，制作石蜡组织切片。显微镜下观察和测量各段肠管绒毛高度及相应隐窝深度，计算绒毛高度/隐窝深度比值（V/C）。1.3.4肠道消化酶活性试验肉兔屠宰取出十二指肠、盲肠的内容物置于5 mL灭菌无酶带盖离心管，液氮速冻20 min，-80 ℃冷冻保存。采用上海酶连生物工程研究所生产的兔的酶联免疫试剂盒，按照操作说明测定十二指肠内容物中蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性和盲肠纤维素酶活性。1.4数据统计与分析数据采用Excel 2010进行处理，采用SPSS 21.0进行方差和卡方分析，Duncan's法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1合生素对断奶肉兔生产性能的影响（见表2）由表2可知，与对照组相比，合生素组肉兔平均日增重、平均日采食量和成活率随合生素添加剂量增加而升高，中剂量组和高剂量组显著高于对照组和低剂量组（P0.05）；各试验组肉兔腹泻率和料重比均有所降低，但组间差异不显著（P0.05）。结果表明，添加合生素的日粮适口性较好，可以促进肉兔生长，预防腹泻，提高成活率。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.01.028.T002表2合生素对断奶肉兔生产性能的影响组别初重/g末重/g平均日增重/[g/(只·d)]平均日采食量/[g/(只·d)]料重比腹泻率/%成活率/%对照组1 221.40±50.202 112.60±23.20b21.21±2.49b74.25±2.26b3.68±1.2314.23±1.3678.32±1.76b低剂量组1 220.60±30.802 240.30±31.50b24.28±1.30b78.95±2.14b3.41±0.8913.96±2.8978.36±3.45b中剂量组1 219.10±50.202 282.6±33.20a25.33±1.52a84.31±2.03a3.32±0.6313.63±3.2189.57±3.25a高剂量组1 220.30±21.902 290.60±38.20a25.48±1.46a85.17±1.96a3.32±0.5413.54±1.2689.33±2.46a注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；表3、表5与此同。2.2合生素对肉兔血清免疫指标的影响（见表3）由表3可知，与对照组相比，随着合生素添加量增加，肉兔血清TP、ALB、IgA和IgG含量均有升高；中剂量组和高剂量组血清TP、ALB、IgA和IgG水平均显著高于对照组和低剂量组（P0.05），但中剂量组和高剂量组间、低剂量组与对照组组间差异不显著（P0.05）。结果表明，合生素添加量达0.04%~0.06%时，可以提高肉兔免疫力。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.01.028.T003表3合生素对断奶肉兔血清免疫指标的影响组别TP/(g/L)ALB/(g/L)IgA/(mg/L)IgG/(mg/L)IgM/(mg/L)对照组53.60±4.09b31.30±3.17b125.50±7.37b1 333.93±56.97b215.78±6.38低剂量组54.90±4.48b33.50±2.37b135.21±3.67b1 487.23±46.48b223.51±7.07中剂量组63.60±3.32a36.70±3.25a154.81±3.99a1 609.07±67.10a225.32±6.89高剂量组65.30±5.38a37.30±2.26a156.23±1.56a1 611.07±47.32a226.63±7.362.3合生素对肉兔肠道形态的影响（见表4）由表4可知，随着合生素添加剂量的提高，各组肉兔十二指肠、空肠、回肠绒毛长度均呈升高趋势，隐窝深度呈降低趋势，但组间差异均不显著（P0.05）。结果表明，合生素对肉兔肠道发育具有一定的促进作用。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.01.028.T004表4合生素对断奶肉兔肠道形态的影响项目对照组低剂量组中剂量组高剂量组十二指肠绒毛高度/μm87.32±2.2391.14±1.2593.14±2.5693.24±3.26隐窝深度/μm33.41±1.7831.45±0.5629.66±4.2328.78±4.65绒毛高度/隐窝深度比值2.63±0.122.89±0.693.14±0.453.24±0.22空肠绒毛高度/μm78.12±5.3678.26±8.2185.36±4.3386.22±2.68隐窝深度/μm26.23±1.5626.15±1.4724.45±1.1123.23±1.32绒毛高度/隐窝深度比值2.98±0.232.99±0.103.49±0.243.71±0.22回肠绒毛高度/μm58.22±1.1165.23±4.5666.12±3.2268.68±2.66隐窝深度/μm28.21±1.3626.02±1.3225.22±3.6525.11±1.33绒毛高度/隐窝深度比值2.06±0.232.51±0.452.62±0.212.74±0.45注：同行数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）。2.4合生素对肉兔肠道消化酶活性的影响（见表5）由表5可知，与对照组相比，各试验组肉兔十二指肠蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶及盲肠纤维素酶活性均有所升高。其中，中剂量组和高剂量组显著高于对照组和低剂量组（P0.05），低剂量组与对照组间、中剂量组和高剂量组组间差异不显著（P0.05）。结果表明，添加0.04%~0.06%合生素可明显提高肉兔肠道消化酶活性，利于营养物质的消化吸收。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.01.028.T005表5合生素对断奶肉兔肠道消化酶活性的影响组别十二指肠蛋白酶十二指肠淀粉酶十二指肠脂肪酶盲肠纤维素酶对照组825.66±21.35b265.10±10.23b34.56±1.45b26.42±0.85b低剂量组843.33±31.21b268.40±12.11b39.52±2.57b26.82±1.05b中剂量组945.36±24.14a327.20±12.54a46.21±1.89a35.82±2.35a高剂量组948.21±28.98a328.30±15.78a49.22±1.65a36.68±2.08aU/L3讨论3.1合生素对肉兔生产性能的影响阎英凯等[9]研究发现，低聚木糖可提高伊普吕配套系肉兔的生长速度和成活率，且对肉兔无任何毒副作用。徐登峰等[1]研究发现，枯草芽孢杆菌制剂可提高断奶肉兔的平均日增重，预防幼兔腹泻。任永军等[4]研究发现，凝结芽孢杆菌制剂可以显著提高新西兰肉兔的平均日增重，降低料重比。本试验将低聚木糖、枯草芽孢杆菌制剂、凝结芽孢杆菌制剂配伍，添加在基础日粮中，连续饲喂肉兔42 d；结果显示，中剂量组和高剂量组肉兔平均日增重平均日采食量、成活率均显著升高，料重比和腹泻率降低，说明该合生素对断奶肉兔促生长和防腹泻效果显著，也进一步验证了兔日粮中联合添加枯草芽孢杆菌制剂、凝结芽孢杆菌制剂和低聚木糖的可行性。3.2合生素对肉兔血清免疫指标的影响血清TP主要由ALB和球蛋白（GLB）组成，可以反映机体的营养状况、蛋白质代谢水平及机体免疫力。裴跃明等[2]和薛云等[10]研究发现，日粮中添加枯草芽孢杆菌能够显著提高獭兔和断奶肉兔血清IgA及IgG含量。陈德林[5]研究发现，凝结芽孢杆菌对肉兔血清内总蛋白、白蛋白和IgG含量无显著性影响，但显著增加了血清IgM含量。周莉芬[11]研究表明，低聚木糖对断奶仔猪血液总蛋白和白蛋白含量无显著影响。李元凤[12]研究发现，母猪饲喂低聚木糖可提高后代仔猪血清IgA含量，且与益生菌联合使用效果更佳。目前，有关低聚木糖对兔血清免疫指标的影响尚未见报道。本研究发现，枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌与低聚木糖配合使用可显著提高断奶肉兔血清TP、ALB、IgA和IgG含量，说明该合生素提高肉兔机体免疫水平的效果显著，也是合生素组肉兔腹泻率降低、成活率增加的主要原因。3.3合生素对肉兔肠道形态的影响肠道是肉兔营养物质吸收的主要场所，小肠绒毛高度和隐窝深度是衡量肠道吸收功能的重要指标。陈德林[5]研究发现，芽孢杆菌可显著增加肉兔十二指肠绒毛长度和绒隐比，但对空肠和回肠的绒毛长度、隐窝深度和绒隐比均无显著影响。陈岗等[13]研究发现，在饲喂芽孢杆菌的中后期，肉兔小肠黏膜厚度和绒毛长度明显增加。任永军等[3]研究发现，枯草芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌联合使用可促进断奶肉兔十二指肠、空肠、回肠绒毛的生长。本研究发现，添加合生素的试验组兔十二指肠、空肠、回肠绒毛长度均有所增加；肠绒毛增长可提高其摆动能力以及与食糜的接触面，促进营养物质吸收，防止有害菌定植。隐窝深度可反映细胞生成率。本试验中添加合生素的试验组肉兔隐窝深度均有所降低，表明肠道成熟上皮细胞数量增多，分泌能力增强，加快受损肠黏膜的修复，维护肠道健康状态。3.4合生素对肉兔肠道消化酶活性的影响肠道消化酶的活性反映其对营养物质的消化利用能力。龙淼等[14]研究表明，从兔肠源枯草芽孢杆菌具有较强产蛋白酶、纤维素酶、半纤维素酶、淀粉酶和几丁质酶能力。霍姝伊等[15]使用0.01%枯草芽孢杆菌替代抗生素添加于断奶仔猪日粮中，连续饲喂30 d，结果发现，仔猪十二指肠、空肠、回肠酸性蛋白酶、α-淀粉酶、脂肪酶纤维素酶活性均提高。苏可等[16]研究发现，芽孢杆菌制剂可提高肉兔十二指肠、空肠、回肠和盲肠蛋白酶、淀粉酶、淀粉酶和纤维素酶活性。吴敏峰[17]研究发现，纤维素酶芽孢杆菌制剂可提高利福尼亚幼兔粪便及肠道中纤维素酶活性及肠壁和空肠内容物淀粉酶活性，但粪便及肠道蛋白酶活性则无明显变化。任永军等[4]研究发现，连续饲喂8 w添加凝结芽孢杆菌的日粮，新西兰肉兔十二指肠淀粉酶、胰蛋白酶和纤维素酶活性显著升高。凝结芽孢杆菌还可提高鱼类肠道淀粉酶的活性和蛋白酶活性[18-19]及禽类空肠食糜蛋白酶及淀粉酶活性[20]。研究表明，低聚木糖作为饲料添加剂可显著提高凡纳滨对虾、仿刺参、草鱼、团头鲂等水产动物肠道消化酶活性[21-23]。低聚木糖单独使用或者与益生菌联合使用可提高禽类和断奶仔猪消化道蛋白质、脂肪和淀粉酶活性[24-25]。因此，该合生素利于激活肠道消化酶活性，促进营养物质的吸收。4结论由低聚木糖+枯草芽孢杆菌+凝结芽孢杆菌配伍而成的合生素，可显著提高肉兔生产性能和免疫水平，改善肠道形态，提高肠道消化酶活性，可作为饲料添加剂应用于肉兔养殖生产中；建议添加剂量为0.04%。