在禽养殖中，在获得相同增重或产蛋量的前提下，减少饲料用量可提高饲料效率，降低生产成本[1]。蛋氨酸（Met）是肉鸡日粮中的第一限制性氨基酸[2]。日粮中添加Met能够促进畜禽生长[3-5]。因此，家禽生长发育过程中对Met把控非常关键。庄河大骨鸡肉质鲜美，深受消费者欢迎[6]。本课题组前期研究提纯选育过程中，初步提出庄河大骨鸡特有的营养需要量[7]，但Met的需要量仍需进一步研究。Musclin mRNA的表达水平随营养水平的改变而变化，SLC12A5的表达水平与胰岛素释放有关[8]。本课题组前期研究表明，日粮中Met水平变化可引起腿肌SLC12A5显著变化[9]，原因可能是Met供应量变化导致肌肉蛋白质代谢发生改变，引起肌肉胰岛素旁分泌发生变化。本试验以锦州医科大学畜牧兽医学院提纯选育的F6代大骨鸡为研究对象，探究日粮Met水平对大骨鸡SLC12A5、Musclin mRNA表达水平的影响，确定日粮Met营养需要量，为庄河大骨鸡的生产实践提供参考。1材料与方法1.1试验设计1 500只庄河大骨鸡公雏饲养至106日龄，选择体重均匀的育成鸡240只，随机分为3组，每组10个重复，每个重复8只。预试期1 w，正式试验期8 w。H组、M组和L组日粮中蛋氨酸（Met）水平分别为0.42%、0.34%、0.25%，其中M组为对照组。试验日粮组成及营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.01.009.T001表1试验日粮组成及营养水平项目L组M组H组原料组成/%玉米63.7563.7563.75麦麸8.008.008.00豆粕16.0016.0016.00玉米酒糟粕8.008.008.00磷酸氢钙1.201.201.20石粉1.201.201.20食盐0.250.250.25小苏打0.200.200.20预混料1.001.001.00蛋氨酸00.090.18胱氨酸0.180.090赖氨酸0.220.220.22合计100.00100.00100.00营养水平代谢能/(MJ/kg)11.0911.0911.09粗蛋白/%15.5015.5015.50钙/%0.750.750.75非植酸磷/%0.340.340.34赖氨酸/%0.800.800.80蛋氨酸/%0.250.340.42蛋氨酸+半胱氨酸/%0.700.700.70色氨酸/%0.160.160.16粗纤维/%3.533.533.53粗脂肪/%3.953.953.95粗灰分/%6.116.116.11注：1.预混料为每千克日粮提供：铁80 mg、铜8 mg、锰100 mg、锌80 mg、碘0.7 mg、硒0.3 mg、VA 6 500 IU、VD 850 IU、VE 12.5 IU、VK 0.85 mg、VB1 0.7 mg、VB2 4.5 mg、泛酸9.2 mg、烟酸28 mg、VB6 2.8 mg、生物素0.14 mg、叶酸0.6 mg、VB12 0.012 mg、胆碱 950 mg。2.营养水平均为计算值。1.2饲养管理试验鸡采用单笼饲养，正常光照，自由饮水，免疫接种程序按常规进行。试验期间每天8：00、12：00、17：00定时喂料，准确记录每天投料量，每周末收集剩余饲料，称重，所有试验鸡称重。1.3测定指标及方法1.3.1血清Met含量试验第16、20和24 w，每组随机抽取4只鸡，屠宰，颈动脉采血，3 000 r/min离心10 min析出血清，-20 ℃保存。血清Met检测采用酶联免疫试剂盒，采用双抗体夹心法进行检测。酶标仪（450 nm处）测定OD值，通过标准曲线计算鸡血清中Met含量。试剂盒购自上海江莱生物科技有限公司。1.3.2胸肌和腿肌Musclin和SLC12A5 mRNA的表达量取试验鸡同侧的胸肌和腿肌液氮冻存。采用SYBR Green实时荧光定量的方法，测定试验鸡胸肌和腿肌Musclin 和SLC12A5 mRNA的表达量。以2-△△Ct法计算待测基因的mRNA相对表达量。1.4数据统计与分析数据采用Microsoft Excel软件整理，采用SPSS 26.0软件进行分析，采用LSD法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著，P0.01表示差异极显著。2结果与分析2.1Met水平对不同周龄大骨鸡公鸡血清Met含量的影响（见表2）由表2可知，第16 w，H组公鸡血清Met含量极显著低于M组和L组（P0.01）。第20 w，L组公鸡血清Met含量显著低于M组（P0.05），但显著高于H组；H组公鸡血清Met含量极显著低于M组（P0.01）。第24 w，H组和L组公鸡血清Met含量均极显著低于M组（P0.01），由高到低分别为M组、L组、H组。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.01.009.T002表2Met水平对不同周龄大骨鸡公鸡血清Met含量的影响组别16 w20 w24 wH组13.424±1.099Bb12.841±2.049Bc12.381±1.551CcM组18.854±1.690Aa20.649±1.485Aa20.396±0.846AaL组17.811±0.827Aa16.538±1.421ABb16.239±1.467Bb注：同列数据肩标不同小写字母表示差异显著（P0.05），不同大写字母表示差异极显著（P0.01），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。ng/L2.2Met水平对不同周龄大骨鸡公鸡Musclin mRNA表达量的影响2.2.1Met水平对不同周龄公鸡腿肌Musclin mRNA表达量的影响（见表3）由表3可知，随着日粮Met水平提高，不同周龄的公鸡腿肌Musclin mRNA表达量均呈升高趋势。第16、20及24 w，L组公鸡腿肌Musclin mRNA表达量均极显著高于H组（P0.01）。第16 w，H组公鸡腿肌Musclin mRNA表达量显著低于M组（P0.05）；第20 w，H组公鸡腿肌Musclin mRNA表达量极显著低于M组（P0.01）；第24 w，H组公鸡腿肌Musclin mRNA表达量略低于M组，但差异不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.01.009.T003表3Met水平对不同周龄公鸡腿肌Musclin mRNA表达量的影响组别16 w20 w24 wH组0.858±0.115Bc0.620±0.018Cc0.949±0.196BbM组1.001±0.057ABb1.001±0.049Bb1.003±0.103ABbL组1.263±0.166Aa1.550±0.095Aa1.407±0.059Aa2.2.2Met水平对不同周龄公鸡胸肌Musclin mRNA表达量的影响（见表4）由表4可知，第16 w，H组、L组公鸡胸肌Musclin mRNA表达量极显著低于M组（P0.01），H组显著高于L组（P0.05）。第20 w，H组公鸡胸肌Musclin mRNA表达量极显著高于其他两组（P0.01），由高到低依次为H组、M组、L组。第24 w，L组公鸡胸肌Musclin mRNA表达量极显著高于H组和M组。（P0.01）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.01.009.T004表4Met水平对不同周龄公鸡胸肌Musclin mRNA表达量的影响组别16 w20 w24 wH组0.537±0.108Bb1.392±0.045Aa0.719±0.059BbM组1.002±0.072Aa1.001±0.066Bb1.000±0.021BbL组0.318±0.018Bc0.557±0.066Cc3.912±0.358Aa2.3Met水平对不同周龄公鸡SLC12A5 mRNA表达量的影响2.3.1Met水平对不同周龄公鸡腿肌SLC12A5 mRNA表达量的影响（见表5）由表5可知，第16 w，L组公鸡腿肌SLC12A5 mRNA表达量极显著高于H组（P0.01），L组显著低于M组（P0.05）。第20 w，H组和L组公鸡腿肌SLC12A5 mRNA表达量显著低于M组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.01.009.T005表5Met水平对不同周龄公鸡腿肌SLC12A5 mRNA表达量的影响组别16 w20 w24 wH组0.235±0.046Bc0.605±0.039b0.836±0.347M组1.095±0.018Aa1.008±0.181a1.000±0.019L组0.840±0.067Ab0.627±0.032b2.359±0.8102.3.2Met水平对不同周龄公鸡胸肌SLC12A5 mRNA表达量的影响（见表6）由表6可知，第16 w，H组公鸡胸肌SLC12A5 mRNA表达量均极显著高于L组（P0.01），显著高于M组（P0.05）。第24 w，H组显著低于M组和L组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.01.009.T006表6Met水平对不同周龄公鸡胸肌SLC12A5 mRNA表达量的影响组别16 w20 w24 wH组1.634±0.160Aa0.867±0.4020.650±0.027bM组1.129±0.130Ab1.001±0.0531.003±0.114aL组0.578±0.130Bc0.792±0.2111.101±0.075a3讨论3.1日粮Met水平对大骨鸡公鸡血清Met含量的影响日粮中的Met在肠道吸收并代谢，通过血液输送至机体的各组织器官进行代谢和转化，多余部分形成尿酸排出[10]。日粮中一种氨基酸供应量不科学、必需氨基酸失衡，可影响其他氨基酸的利用[11]。叶慧等[12]研究表明，适宜的蛋氨酸可降低21日龄狮头鹅血清中的尿酸水平。Met过多或过少均可干扰肝脏Met的正常代谢[13-14]，抑制机体生长，引起中毒。血清Met水平是日粮Met经肠道吸收、机体代谢的结果，可直接表明Met供应水平是否适宜。0.34%日粮Met接近大骨鸡公鸡的营养需要，因此设定为适宜的中等Met水平组。本研究结果发现，在中等日粮Met水平基础上，血清Met含量随日粮Met水平降低而显著降低；提高日粮Met，血清Met水平不升高反而极显著降低，甚至低于低Met水平组，说明过量Met启动了机体的自身代谢机制而被机体迅速清除，血清Met水平大幅度下降。3.2Met水平对大骨鸡公鸡腿肌和胸肌Musclin mRNA表达量的影响Musclin与OSTN同属一个基因编码，在动物组织中所处在不同生长发育阶段，其表达量不同。研究发现，提高骨中的环磷酸鸟苷（cGMP）可使Musclin转基因小鼠的管状骨增长并呈后凸趋势[15]，Musclin提高了C型利钠肽（CNP）浓度和cGMP在骨中的含量，增强利钠肽受体鸟苷酸环化酶（GC-B）的活化，刺激软骨细胞增殖[16]，即Msuclin与成骨有关。Musclin主要来源于骨骼肌的IIb型肌纤维[17]，对畜禽骨骼肌肌肉生长、营养代谢具有调控作用[18-19]。绵羊Musclin基因过表达可减弱胰岛素作用，影响肌细胞糖代谢，二者相互协调维持糖代谢稳态，其作用机制与绵羊成肌细胞的分化状态有关[20]。研究发现，Musclin的表达量可随猪月龄增长而提高，瘦肉型猪肌肉和皮下组织中Musclin表达量显著高于脂肪型猪[21]，即Msuclin与蛋白质合成有关。本试验中，大骨鸡腿肌Musclin mRNA表达量随日粮Met含量提高而降低，表明高Met水平可抑制腿肌IIb型肌纤维蛋白质合成。3.3Met水平对大骨鸡公鸡腿肌和胸肌SLC12A5 mRNA表达量的影响SLC12A5基因在动物体内具有重要功能，可维持神经元内氯离子的稳态，其表达量影响动物体内重要的代谢途径。本试验结果显示，16周龄的M组和L组大骨鸡腿肌SLC12A5 mRNA表达量均极显著高于H组，说明0.25%~0.34% Met水平更有利于SLC12A5基因表达，0.42%Met水平可使表达量显著降低。SLC12A5基因表达量降低可导致神经元内的氯挤压能力减弱，损害γ-氨基丁酸（GABA）信号的抑制强度，引起膜兴奋性增加[22]。SLC12A5的表达量与胰岛素分泌有关[23]。本试验中，16周龄的M组、L组腿肌SLC12A5基因表达量均极显著高于H组，M组显著高于L组，说明机体糖代谢显著增强；20周龄的L组大骨鸡腿肌SLC12A5基因表达量显著低于M组，表明低Met水平能够影响腿肌糖代谢；24周龄的L组大骨鸡腿肌SLC12A5基因表达量与M组无显著差异，说明低Met水平可导致氨基酸不平衡，形成代谢反馈。本试验中，16周龄M组胸肌SLC12A5基因表达量显著低于H组，说明高氨基酸水平日粮更利于SLC12A5基因表达；20周龄时各组胸肌SLC12A5基因表达量无显著差异，但M组数值高于其他两组，说明氨基酸不平衡形成代谢反馈；24周龄M组和L组胸肌SLC12A5基因表达量显著高于H组，说明过高水平的Met不利于SLC12A5基因表达。结合前期RNA-Seq和蛋白质组等相关研究发现，饲喂中等Met水平日粮时，一些基因的表达量最高；而高和低Met水平均可导致基因表达量降低，不呈剂量-效应关系。SLC12A5基因表达量是否受日粮Met水平调控，尚需进一步研究。4结论日粮Met水平影响17~24周龄大骨鸡公鸡血清Met含量，适宜的中水平组含量最高，最低的是高水平组。日粮Met水平能够显著影响公鸡腿肌Musclin mRNA表达量，低水平组表达量最高，高水平组最低。因此，可以考虑将大骨鸡公鸡血清Met水平和腿肌Musclin mRNA表达量作为大骨鸡日粮Met水平的生物标志物。