犬细小病毒病是由犬细小病毒（canine parvovirus，CPV）引起的急性传染病，可通过呕吐物、粪便及唾液传播。犬细小病毒病发病率、病死率高，传染性强[1-2]，多发生于寒冷季节，6月龄以下幼犬最易感，纯种犬较杂种犬发病率明显更高[3-4]。临床上可分为肠炎型和心肌炎型。肠炎型的主要临床表现为呕吐、腹泻、体温升高、粪便稀而腥臭、体重明显下降；心肌炎型则无明显临床特征，易突然衰竭死亡[5-6]。犬冠状病毒病是一种由犬冠状病毒（canine coronavirus，CCV）引起的高度接触性肠道传染病，以急性肠炎、水样腹泻、血便、呕吐和脱水为主要特征[7-9]。该病多发于寒冷季节，主要通过粪便传播，也可垂直传播，2~4月龄幼犬感染发病率几乎为100%，病死率50%；成年犬的病死率相对较低[10-11]。贾第鞭毛虫（Giardia）寄生于动物小肠，可引起人畜共患的慢性肠道原虫性感染疾病，即贾第鞭毛虫病[12-13]。Giardia多感染6月龄以下的幼年犬猫，主要临床表现为幼年犬猫急性、慢性或间歇性腹泻以及长期腹泻导致营养不良、发育迟缓；成年犬猫感染后多无临床表现。该病以粪便及污水为主要传播途径，流行率高，严重时可继发犬细小病毒病及犬冠状病毒病等严重传染病[14-15]。上述动物传染病均以传染性极强为主要特征，尤其易对幼年犬猫的健康造成危害，及时发现治疗尤为重要。胶体金检测为临床上最方便快捷的检测方法之一。因此，本研究采用胶体金免疫层析技术，制备可快速检测CPV、CCV和Giardia的三合一胶体金检测卡，评价其检测效果，为CPV、CCV和Giardia的临床诊断提供参考。1材料与方法1.1试剂与仪器主要试剂：抗犬细小病毒抗体（CPV-Ab1）、抗犬细小病毒抗体（CPV-Ab2）、抗犬冠状病毒抗体（CCV-Ab1）、抗犬冠状病毒抗体（CCV-Ab2）、抗贾第鞭毛虫抗体（Giardia-Ab1）、抗贾第鞭毛虫抗体（Giardia-Ab2）、鼠IgG、羊抗鼠IgG均购自傲锐生物医药科技有限公司；链霉亲和素和生物素购自Sigma公司；犬细小病毒阳性样本（CPV-Ag）、犬冠状病毒阳性样本（CCV-Ag）和贾第鞭毛虫阳性样本（Giardia-Ag）均由杭州宠物医院提供。主要仪器：连续点膜机及点金标机（海宁威尔芬自动化设备有限公司）、可编程切割机（杭州格伦坤科技有限公司）、鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）。1.2CPV+CCV+Giardia抗原三合一胶体金检测卡的制备1.2.1胶体金颗粒的制备1 mL 1%的氯金酸加入双蒸水定容至100 mL，煮沸后保持3 min，搅拌并快速加入2 mL 1%的柠檬酸三钠溶液；95 °C搅拌6~8 min，冷却后定容至原体积，4 °C保存。1.2.2胶体金标记抗体取3份适量的胶体金溶液，分别调至最适pH值，加入CPV-Ab1、CPV-Ab1、Giardia-Ab1，充分搅拌1 h；加入20%的浓度为0.2% PEG-2000稳定剂，1 200 r/min离心30 min，4 °C保存。1.2.3金标垫的制备将已被胶体金标记的CPV-Ab1、CCV-Ab1、Giardia-Ab1分别与鼠IgG金标抗体复合物混合，均匀涂布于聚酯纤维膜，37 °C烘干，封入装有干燥剂的铝箔袋。1.2.4NC膜的制备1.2.4.1CCV胶体金检测条的NC膜的制备将链霉亲和素和羊抗鼠IgG作为检测线（T线）和质控线（C线）分别包被于NC膜，37 °C烘干，封入装有干燥剂的铝箔袋。1.2.4.2CPV胶体金检测条和Giardia胶体金检测条的NC膜的制备将CPV-Ab2、Giardia-Ab2和羊抗鼠IgG作为检测线（T线）和质控线（C线）分别包被于NC膜，37 °C烘干，干燥密封保存。1.2.5CCV样品垫的制备CCV-Ab2与生物素（biotin）耦联，按照0.006 g/L浓度加入玻纤溶液混匀，均匀涂布于玻璃纤维，37 °C烘干，干燥密封保存。1.2.6CPV+CCV+Giardia抗原三合一胶体金检测卡的组装将准备的3个产品的样品垫、金标垫、NC膜、吸水垫分别依次粘贴于各自洁净的PVC，切割4.0 mm宽的试纸条，按顺序装入三合一测试板，干燥密封保存。1.3检测原理、判定标准及检测方法1.3.1CCV检测原理及判定标准采用链霉亲和素和生物素信号放大的双抗夹心法进行检测。若样本中含有犬冠状病毒抗原（CCV-Ag），则与样本垫中的CCV-Ab2-biotin结合，被金标垫上的CCV-Ab1捕获，形成CCV-Ab2-biotin-CCVAg-CCV-Ab1抗体金标复合物；在横向层析的作用下继续流动至NC膜，被T线处的链霉亲和素捕获，形成抗体-抗原-抗体固相复合物，呈现红色条带；继续层析至质控线C处，溶液中的鼠IgG金标物与羊抗鼠IgG结合，呈现红色条带。若样本中不含有CCV-Ag，则检测线处不呈现红色条带，仅质检线处呈现红色条带。1.3.2CPV、Giardia检测原理及判定标准采用双抗夹心法进行检测。若样本中含有犬细小病毒抗原（CPV-Ag），则与金标垫中的犬细小病毒抗体（CPV-Ab2）结合；在横向层析的作用下，继续流动至NC膜，被T线处的犬细小病毒抗体（CPV-Ab1）捕获，形成CPV-Ab2-CPV-Ag-CPV-Ab1抗体抗原固相复合物，呈现红色条带；继续层析至质控线C处，溶液中的鼠IgG金标物与羊抗鼠IgG结合，呈现红色条带。若样本中不含有CCV-Ag，则检测线处不呈现红色条带，仅质检线处呈现红色条带。Giardia检测同理。1.3.3检测方法于地上或犬的肛门处采集适量犬呕吐物或粪便，与缓冲液搅拌混匀取出，确保充分提取样品。将测试板置于干净平整的表面，分别垂直滴加3滴样品（约120 μL）于测试板S孔，5~10 min判读结果，15 min后结果无效。1.4CPV+CCV+Giardia抗原三合一胶体金检测卡质量评价试验1.4.1特异性试验采用3个批次各9个CPV、CCV和Giardia抗原胶体金检测卡分别检测CDV、CPV、CAV、CRV、CCV和Giardia的阳性样本，观察并记录结果，评价其特异性。1.4.2灵敏度试验将CPV高浓度阳性样本稀释成不同浓度：320.0、160.0、80.0、40.0、20.0、10.0、5.0和2.5 HAU/mL；将高浓度的CCV重组抗原稀释成不同浓度：100.0、50.0、25.0、10.0、5.0、2.0、1.0、0.5 μg/L；将Giardia高浓度样本稀释为不同浓度：625 000、125 000、62 500、31 250、15 625、3 125、2 500、1 000、500和0 cysts/mL。采用组装好的CPV、CCV及Giardia抗原胶体金检测卡分别测试，观察并记录结果，评价其灵敏度。1.4.3重复性试验分别制备3批CPV＋CCV＋Giardia抗原胶体金检测卡，采用3个批次的胶体金检测卡分别检测CPV、CCV和Giardia的阴性、中阳性和高阳性样品。每一批次每组样本各10份，观察并记录结果，评价其在同批次和不同批次间的重复性。1.4.4稳定性试验1.4.4.1加速稳定性试验制备3批CPV、CCV和Giardia抗原胶体金检测卡，分别45 °C保存0、7、14、21、28、35、42、56、77、84 d和55 °C下0、7、14、21、28、35、42 d后进行试验。每个时间点分别检测CPV、CCV和Giardia阴性对照品、弱阳性对照品、中阳性对照品和强阳性对照品各3份，观察并记录结果。1.4.4.2实时稳定性试验制备3批CPV、CCV和Giardia抗原胶体金检测卡，室温条件进行0、6、12、15、18、21、24月的稳定性试验。每个时间点分别检测CPV、CCV和Giardia阴性对照品、弱阳性对照品、中阳性对照品和强阳性对照品各3份，观察并记录结果。1.4.5与RT-qPCR检测结果符合率收集经RT-qPCR检测的3批数量分别为82、179和162个的临床样本，采用CPV、CCV及Giardia抗原胶体金检测卡分别进行检测，观察记录结果并计算胶体金检测与RT-qPCR检测结果符合率。1.4.6与其他品牌检测结果对比分别采用上述制备的CPV、CCV和Giardia抗原胶体金检测卡与A公司的CPV、CCV和Giardia抗原胶体金检测卡分别对CPV、CCV和Giardia阴性和样本各7份进行检测，观察并记录结果。2结果与分析2.1特异性试验结果（见表1）由表1可知，仅CPV阳性样本在CPV检测线和质检线处出现红色条带，结果为阳性；仅CCV阳性样本在CCV检测线和质检线处出现红色条带，结果为阳性；仅Giardia阳性样本在Giardia抗原检测线和质检线处出现红色条带，结果为阳性；其余结果均为阴性。结果表明，CPV胶体金检测卡与CDV、CAV、CRV、CCV和Giardia均无交叉反应；CCV胶体金检测卡与CDV、CAV、CRV、CPV和Giardia均无交叉反应；Giardia抗原胶体金检测卡与CDV、CAV、CRV、CCV和CPV均无交叉反应。CPV、CCV及Giardia抗原胶体金检测卡均特异性良好。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.01.013.T001表1特异性试验结果Tab.1Results of specificity test项目CPVCCVGiardia阴性数阳性数阴性数阳性数阴性数阳性数CDV阳性909090CAV阳性909090CRV阳性909090CCV阳性900990Giardia阳性909009CPV阳性099090个2.2灵敏度试验结果（见表2）由表2可知，CPV-Ag浓度分别为320.0、160.0、80.0、40.0、20.0、10.0 HAU/mL时，均呈阳性结果；浓度低于10.0 HAU/mL时，呈可疑结果或阴性结果。CCV-Ag浓度分别为100.0、50.0、25.0、10.0、5.0、2.0 μg/L时，均呈阳性结果；浓度低于2.0 μg/L时，呈可疑结果或阴性结果。Giardia-Ag浓度分别为625 000、125 000、62 500、31 250、15 625、3 125 cysts/mL时，均呈阳性结果；浓度低于3 125 cysts/mL时，呈阴性结果。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.01.013.T002表2灵敏度试验结果Tab.2Results of sensitivity test项目CPV项目CDV项目Giardia阳性数可疑数阴性数阳性数可疑数阴性数阳性数阴性数原始浓度900原始浓度900625 000 cysts/mL90320.0 HAU/mL900100.0 μg/L900125 000 cysts/mL90160.0 HAU/mL90050.0 μg/L90062 500 cysts/mL9080.0 HAU/mL90025.0 μg/L90031 250 cysts/mL9040.0 HAU/mL90010.0 μg/L90015 625 cysts/mL9020.0 HAU/mL9005.0 μg/L9003 125 cysts/mL9010.0 HAU/mL9002.0 μg/L9002 500 cysts/mL185.0 HAU/mL0181.0 μg/L0361 000 cysts/mL092.5 HAU/mL0090.5 μg/L009500 cysts/mL09个结果表明，CPV、CCV及Giardia抗原胶体金检测卡灵敏度均较好，分别可检测CPV-Ag浓度低至10.0 HAU/mL的样本、CCV-Ag浓度低至2.0 μg/L的样本和Giardia-Ag浓度低至3 125 cysts/mL的样本。2.3重复性试验结果（见表3）由表3可知，同批次CPV、CCV及Giardia抗原胶体金检测卡分别检测10份阴性样本，结果均为阴性；分别检测10份中阳性样本和强阳性样本，结果均为阳性；且不同批次同组样本的检测结果也一致。结果表明，CPV、CCV及Giardia抗原胶体金检测卡的重复性均良好。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.01.013.T003表3重复性试验结果Table 3Results of reproducible experimental项目阳性数阴性数CPV阴性010CPV中阳性100CPV强阳性100CCV阴性010CCV中阳性100CCV强阳性100Giardia阴性010Giardia中阳性100Giardia强阳性100个2.4稳定性试验结果2.4.1加速稳定性试验结果同一批次及不同批次内共9个检测板，使用CPV、CCV和Giardia阴性样本分别于45 °C条件下0、7、14、21、28、35、42、56、77、84 d和55 °C下0、7、14、21、28、35、42 d检测，均显示阴性；CPV、CCV和Giardia弱阳性样本、中阳性样本和强阳性样本检测时均显示阳性。结果表明，CPV、CCV及Giardia抗原胶体金检测卡在45 °C 84 d或在55 °C 42 d时的检测结果均有效;根据阿伦尼乌斯公式推算该产品可保存2年。2.4.2实时稳定性试验结果同一批次和不同批次内共9个测试板使用CPV、CCV和Giardia阴性样本在0、6、12、15、18、21、24月检测，结果均显示阴性；CPV、CCV和Giardia弱阳性样本、中阳性样本和强阳性样本检测结果均显示阳性。结果表明，该产品在24月内具有稳定性。2.5与RT-qPCR检测结果符合率（见表4）由表4可知，与RT-qPCR检测结果相比，胶体金检测卡检测CPV的阴性符合率为100.00%，阳性符合率为95.74%，总符合率为97.56%；CCV的阴性符合率为97.52%，阳性符合率为93.10%，总符合率为96.09%；Giardia的阴性符合率为95.87%，阳性符合率为95.12%，总符合率为95.68%。结果表明，CPV、CCV和Giardia抗原胶体金检测卡检测与RT-qPCR检测结果基本一致。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.01.013.T004表4RT-qPCR与胶体金检测结果比较Tab.4Comparison of RT-qPCR and colloidal gold detection results项目RT-qPCR结果样本数量胶体金结果阴性数胶体金结果阳性数CPV阴性35350阳性47245CCV阴性1211183阳性58454Giardia阴性1211165阳性41239个2.6与其他品牌产品检测对照结果（见表5）由表5可知，CPV、CCV和Giardia各7份阴性样本通过二者的检测在检测线处均无红色条带出现，质检线处出现红色条带，显示阴性；CPV、CCV和Giardia各7份阳性样本通过二者的检测在检测线和质检线处均出现红色条带，显示阴性。结果表明，二者产品均能够有效检测CPV、CCV及Giardia。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.01.013.T005表5与其他品牌产品检测对照结果Tab.5Results of controled test with A company项目样本属性自研产品检测结果其他品牌产品检测结果阴性数阳性数阴性数阳性数CPV阴性7070阳性0707CCV阴性7070阳性0707Giardia阴性7070阳性0707个3讨论各项试验结果表明，制备的CPV+CCV+Giardia抗原三合一胶体金检测卡具有良好的特异性，不与CDV-Ag、CAV-Ag、CRV-Ag、CCV-Ag、Giardia-Ag和CPV-Ag除对应抗原外任何一种抗原发生交叉反应；灵敏度较高，分别可检测CPV浓度低至10.0 HAU/mL的样本、CCV浓度低至2.0 μg/L的样本和Giardia浓度低至3 125 cysts/mL的样本；对于不同批次或同批次的不同样本的检测重复性良好；45 °C 84 d内或在55°C 42 d内热稳定性良好，室温条件下24个月内均稳定，检测效果良好；对经RT-qPCR检测的82个CPV相关样本、179个CCV相关样本以及162个Giardia相关样本进行胶体金检测，结果显示，与RT-qPCR检测结果相比，胶体金检测卡检测CPV的阴性符合率为100.00%，阳性符合率为95.74%，总符合率为97.56%；CCV的阴性符合率为97.52%，阳性符合率为93.10%，总符合率为96.09%；Giardia的阴性符合率为95.87%，阳性符合率为95.12%，总符合率为95.68%，其检测结果基本一致。4结论本试验制备的CPV+CCV+Giardia抗原三合一胶体金检测卡具有特异性好、灵敏度高、重复性好、稳定性高、结果准确率高的优点，能够快速、准确地检测CPV、CCV及Giardia抗原。