GOD能够专一氧化β-D-葡萄糖，生成葡萄糖酸和H2O2。葡萄糖酸能够降低肠道pH值，促进乳酸菌等有益菌生长，而H2O2达到一定浓度时，能够抑制肠道内有害菌群的生长繁殖，优化肠道菌群结构，改善肉鸡肠道健康[1-2]。乳酸菌制剂作为一种微生态制剂，进入肠道内可通过分解糖类产生乳酸、乙酸等，降低胃肠环境的pH值，抑制有害菌繁殖，促进有益菌生长[3]。乳酸菌作为动物肠道内的优势菌群，能够在胃肠道内黏附定植，与肠黏膜紧密结合，形成生物学保护屏障，竞争性排斥、阻挡病原菌的繁殖[4]。在肉鸡养殖中，健康的肠道环境对预防疾病发生具有重要作用，肠道微生物的菌群组成和稳定是保证肠道健康的重要因素。菌群结构紊乱严重影响肉鸡的生产性能，增加疾病发生的概率[5]。本课题组前期研究了葡萄糖氧化酶和乳酸菌制剂对肉鸡生长性能的影响，二者可以明显改善肉鸡的生长性能[6]。因此，本试验以AA肉鸡作为研究对象，探讨GOD和乳酸菌制剂单独及联合应用对肉鸡肠道形态和肠道微生物菌群的影响，为GOD和乳酸菌制剂联合在肉鸡生产中的应用与推广提供参考。1材料与方法1.1试验材料1日龄AA肉鸡购自北京爱拔益加家禽育种有限公司。GOD由黑龙江卫诺恩生物公司提供。乳酸菌制剂为嗜酸性乳酸杆菌，活菌数为1.5×109 CFU/g，购自北京新水利康科技发展有限责任公司。1.2试验日粮试验采用玉米-豆粕型基础日粮，参照NRC（1994）肉鸡饲养标准进行配制，基础日粮组成及营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.02.008.T001表1基础日粮组成及营养水平（风干基础）项目1~21 d22~42 d原料组成/%玉米61.2064.00豆粕32.0028.50鱼粉1.500.03豆油1.303.40赖氨酸0.070.09DL-蛋氨酸0.180.15氯化胆碱0.100.14石粉1.221.12磷酸氢钙1.131.27食盐0.300.30预混料1.001.00合计100.00100.00营养水平代谢能/(MJ/kg)12.8412.81粗蛋白/%20.4719.36钙/%0.870.91磷/%0.680.64有效磷/%0.430.35赖氨酸/%1.271.14蛋氨酸/%0.520.48赖氨酸+半胱氨酸/%0.810.75注：1.每千克预混料为日粮提供：VA 150 000 IU、VD3 100 000 IU、VE 300 IU、VK3 30 mg、VB1 30 mg、VB2 100 mg、VB6 60 mg、VB12 0.3 mg、烟酸1 000 mg、泛酸200 mg、叶酸20 mg、生物素2 mg、铁1 200 mg、铜40 mg、锰1 000 mg、锌1 000 mg、碘20 mg、硒2 mg。2.营养水平中代谢能为计算值，其余均为实测值。1.3试验设计选取1日龄体重（43.66±0.92）g健康程度良好的AA肉鸡1 200只，随机分为4组，每组6个重复，每个重复50只鸡。其中Ⅰ组为对照组，正常饮水；Ⅱ组为GOD组，在饮水中添加0.1% GOD；Ⅲ组为乳酸菌制剂组，在每只鸡饮水中添加1.5×105 CFU/(g·d)乳酸菌制剂；Ⅳ组为GOD与乳酸菌制剂联合应用组，添加剂量同试验Ⅱ组和Ⅲ组。试验期42 d。试验期间，每天9：00将乳酸菌固体制剂片以少量生理盐水稀释，溶于自来水，饲喂前停水2 h，并要求在1 h内饮完。1.4饲养管理试验采取网上平养的方式，提供独立的料桶、饮水器，鸡只自由采食和饮水。采取人工补充光照制度，连续光照72 h，第4 d起至试验结束，每天提供光照23 h。舍内温度第1 w保持33~35 ℃，以后每周降低2~3 ℃，至第4 w保持22~24 ℃。按照常规免疫程序进行免疫。1.5样品采集及处理分别于试验第21 d和42 d时，每个重复随机取2只体重相近的肉鸡颈静脉放血处死，剪取约2 cm十二指肠、空肠和回肠中段，冲洗干净，4%的多聚甲醛固定液固定，制备常规石蜡切片。试验第42 d，每个重复随机取1只体重相近的肉鸡颈静脉放血处死，盲肠端剪一小口，在酒精灯附近将内容物挤入5 mL灭菌的离心管中，液氮-80 ℃冰箱保存。每组随机取3个样品，编号如下：对照组为42C1、42C2、42C3，GOD组42G1、42G2、42G3，乳酸菌制剂组为42R1、42R2、42R3，联合应用组为42GR1、42GR2、42GR3，送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行高通量测序。1.6微生物信息学分析因高通量测序序列中含有barcode序列以及测序时加入的引物和接头序列，需要去除引物接头序列，根据PE reads之间的overlap关系，将成对的reads拼接成一条序列；按照barcode标签序列识别并区分各样本数据，进行质控过滤获得有效数据。采用Usearch软件对所得有效数据进行操作分类单元（OTU）聚类分析，根据序列之间的97%的相似水平下将序列分成不同的OUT。基于OUT进行后续的Alpha多样性分析及分类学信息分析。1.7数据统计与分析试验数据采用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析（One-way ANOVA），Duncan's法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著，P0.01表示差异极显著。2结果与分析2.1GOD和乳酸菌制剂对肉鸡肠道形态的影响（见表2~表4、图1）由表2可知，试验第21 d，与对照组相比，各试验组肉鸡十二指肠绒毛高度分别提高了7.88%、8.22%和11.27%（P0.05），V/C分别提高了15.73%、16.56%和9.66%（P0.05）。各试验组与对照组之间的隐窝深度均无显著差异（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.02.008.T002表2GOD和乳酸菌制剂对肉鸡十二指肠形态的影响组别绒毛高度/μm隐窝深度/μmV/C值21 d42 d21 d42 d21 d42 d试验Ⅰ组（对照组）948.55±31.26b1 069.66±68.54b196.53±7.65255.89±8.954.83±0.25b4.18±0.17b试验Ⅱ组1 023.32±49.56a1 219.75±110.25a184.15±14.78248.97±20.735.59±0.62a4.95±0.79ab试验Ⅲ组1 026.53±67.22a1 066.02±44.88ab182.71±14.27246.33±10.565.63±0.30a4.33±0.17b试验Ⅳ组1 055.42±79.01a1 216.26±112.23a188.45±18.84246.97±19.405.55±0.57a4.97±0.45a注：同列数据肩标不同小写字母表示差异显著（P0.05），不同大写字母表示差异极显著（P0.01），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。试验第42 d，与对照组相比，试验Ⅱ组和试验Ⅳ组鸡十二指肠绒毛高度显著提高（P0.05），试验Ⅳ组V/C显著增加（P0.05）。与单独使用乳酸菌制剂的试验Ⅲ组相比，联合应用GOD与乳酸菌制剂的试验Ⅳ组V/C显著增加（P0.05），表明联合应用组的效果优于两者单独应用。由表3可知，试验第21 d，与对照组相比，各试验组肉鸡空肠绒毛高度均显著提高（P0.05）；试验Ⅳ组肉鸡的空肠V/C显著高于对照组（P0.05）；各组间的空肠隐窝深度均无显著差异（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.02.008.T003表3葡萄糖氧化酶和乳酸菌制剂对肉鸡空肠形态的影响组别绒毛高度/μm隐窝深度/μmV/C值21 d42 d21 d42 d21 d42 d试验Ⅰ组（对照组）807.62±18.86b906.16±9.26154.55±9.08191.12±16.355.24±0.31b4.77±0.47试验Ⅱ组830.37±20.30a917.03±22.03145.03±10.01178.51±12.595.74±0.37ab5.16±0.44试验Ⅲ组815.32±22.17a911.25±23.89145.91±13.11186.73±14.885.62±0.49ab4.91±0.51试验Ⅳ组841.33±24.25a925.02±13.39146.50±9.27181.27±15.445.77±0.48a5.13±0.45试验第42 d，与对照组相比，各试验组肉鸡空肠绒毛高度、V/C均有提高趋势，隐窝深度有所改善，但差异均不显著（P0.05）。由表4可知，试验第21 d，与对照组相比，试验Ⅳ组肉鸡回肠绒毛高度显著提高（P0.05），试验Ⅱ组、试验Ⅲ组肉鸡回肠绒毛高度相比对照组有所提高，但无显著差异（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.02.008.T004表4葡萄糖氧化酶和乳酸菌制剂对肉鸡回肠形态的影响组别绒毛高度/μm隐窝深度/μmV/C值21 d42 d21 d42 d21 d42 d试验Ⅰ组（对照组）591.08±18.78b611.08±27.18128.96±8.21155.63±23.184.60±0.263.98±0.49试验Ⅱ组618.83±31.60ab630.26±26.69120.51±8.49148.73±10.285.16±0.434.29±0.27试验Ⅲ组602.71±31.80ab618.97±19.37130.49±19.01156.42±17.894.70±0.704.00±0.50试验Ⅳ组626.47±33.98a628.30±36.59124.52±10.47149.18±14.965.01±0.594.25±0.56试验第42 d，与对照组相比，各试验组肉鸡回肠绒毛高度、隐窝深度、V/C均无显著差异（P0.05）。如图1可知，对照组的肠绒毛发育不良，有黏连和脱落，界限不清，单位视野中的肠绒毛较少；各试验组的绒毛整齐且界限清楚，单位视野中的绒毛相对较多。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.02.008.F001图1肉鸡肠道组织结构注：A~D依次为对照组、GOD组、乳酸菌制剂组和联合应用组的十二指肠组织切片；E~H分别为对照组、GOD组、乳酸菌制剂组和联合组的空肠组织切片；I~L分别为对照组、GOD、乳酸菌制剂组和联合组的回肠组织切片。2.2葡萄糖氧化酶和乳酸菌制剂对肉鸡肠道菌群的影响2.2.1盲肠微生物多样性分析（见图2、表5）如图2可知，各组中肉鸡盲肠微生物Simpson多样性指数曲线趋于平坦，说明测序基本覆盖了各组样品的信息。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.02.008.F002图2测序深度评价曲线由表5可知，各样品的Coverage指数均在0.99以上，表明样本中未被测出的序列概率很低。与对照组相比，试验Ⅱ组、试验Ⅲ组以及试验Ⅳ组的Alpha多样性指数均无显著差异（P0.05），表明所添加制剂未显著改变肉鸡的肠道菌群。根据ACE和Chao1指数结果可知，试验Ⅲ组ACE指数最高，试验Ⅳ组Chao1指数最高，表明其菌群丰度最高，但与对照组相比，菌群丰度差异不显著（P0.05）。与对照组比较，各试验组Shannon指数均高于对照组（P0.05），Simpson指数均低于对照组（P0.05），表明各试验组肉鸡肠道菌群的多样性有所改善，但效果不明显。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.02.008.T005表5葡萄糖氧化酶和乳酸菌制剂对肉鸡盲肠微生物Alpha多样性的影响组别Coverage指数ACE指数Chao1指数Shannon指数Simpson指数试验Ⅰ组（对照组）0.998848.02±153.63786.31±102.603.39±0.890.15±0.15试验Ⅱ组0.997900.95±116.15821.70±57.294.20±0.210.04±0.01试验Ⅲ组0.998972.10±291.71821.82±166.313.81±0.310.06±0.03试验Ⅳ组0.998945.03±256.25862.77±164.64.09±0.410.05±0.342.2.2盲肠微生物群落结构分析（见表6~表7）由表6可知，各组盲肠微生物在门水平上主要由厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、变形菌门（Proteobacteria）、互养菌门（Synergistetes）、未分类菌门（Unclassified）、疣微菌门（Verrucomicrobia）和放线菌门（Actinobacteria）以及其他占比例较小的菌群门类组成。与对照组相比，试验Ⅱ组Bacteroidetes的含量极显著提高（P0.01），试验Ⅳ组Bacteroidetes含量显著提高（P0.05）。试验Ⅲ组Proteobacteria含量最高，比其他组均显著提高（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.02.008.T006表6葡萄糖氧化酶和乳酸菌制剂对肉鸡盲肠微生物门水平上菌群相对丰度的影响组别厚壁菌门拟杆菌门变形菌门互养菌门疣微菌门放线菌门试验Ⅰ组（对照组）88.54±4.825.32±6.26Bb3.13±2.52b1.53±1.100.29±0.180.15±0.12试验Ⅱ组72.14±3.8422.86±4.69Aa3.32±2.18b0.58±0.530.47±0.620.24±0.08试验Ⅲ组75.79±6.673.03±0.79Ba20.17±10.17a0.62±0.450.18±0.160.47±0.28试验Ⅳ组79.74±8.1213.85±8.94a3.58±1.10b0.92±0.400.80±1.000.32±0.17%由表7可知，各组盲肠微生物在属水平上主要由乳酸杆菌属（Lactobacillus）、梭状芽孢杆菌属（Clostridium XlVa）、另枝菌属（Alistipes）等为主。与对照组比，试验Ⅳ组Lactobacillus比例稍有提高，但无显著差异（P0.05）；试验Ⅱ组和试验Ⅲ组均有所下降（P0.05）。试验Ⅱ组狄氏副拟杆菌（Parabacteroides）和长栖粪杆菌（Faecalibacterium）比例显著高于其他3组（P0.05）。与对照组比较，试验Ⅱ组和试验Ⅳ组志贺菌属（Escherichia-Shigella）分别比对照组降低了25.0%和37.5%，但差异不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.02.008.T007表7葡萄糖氧化酶和乳酸菌制剂对肉鸡盲肠微生物属水平上菌群相对丰度的影响组别乳酸杆菌属梭状芽孢杆菌属另枝菌属狄氏副拟杆菌长栖粪杆菌志贺菌属试验Ⅰ组16.57±10.086.23±3.963.24±3.710.34±0.49b0.07±0.05b0.08±0.01试验Ⅱ组11.07±4.583.91±1.657.63±5.063.39±4.19a2.68±2.30a0.06±0.03试验Ⅲ组9.50±2.9211.79±7.303.38±0.820.04±0.03b0.09±0.11b0.08±0.04试验Ⅳ组17.50±11.794.60±0.115.05±3.930.50±0.25b0.75±1.08b0.05±0.10%3讨论3.1葡萄糖氧化酶和乳酸菌制剂对肉鸡肠道形态的影响小肠形态结构发育直接与动物的吸收能力相关，小肠绒毛高度、隐窝深度和V/C值是评价小肠形态和衡量肠道消化吸收功能的重要指标。肠绒毛是小肠黏膜的主要组织，绒毛高度与上皮细胞的数量呈正相关，绒毛高度增加，可增加成熟上皮细胞与食糜的接触面积，利于养分吸收[7-8]。隐窝深度能够反映上皮细胞的生成速度，隐窝变浅，表明成熟上皮细胞增加，分泌功能增强，促进肠道的吸收功能。V/C值能够综合反映小肠绒毛的功能状态，比值上升，表明肠黏膜形态改善，吸收功能增强，反之则表明表面肠道黏膜受损，消化率下降[9]。良好的肠道形态有利于促进营养物质的吸收，提高饲料转化率，进而提高肉鸡的生长性能。玄家洁[10]研究表明，在饮水中添加3%的乳酸菌复合物，能够显著提高肉鸡十二指肠绒毛高度和V/C值，降低隐窝深度，对改善肉鸡的生长性能具有协同作用。本试验前期研究发现，GOD和乳酸菌制联合应用可显著提高试验第21 d和42 d肉鸡的十二指肠绒毛高度、V/C值以及21 d空肠和回肠的绒毛高度，在提高生长性能方面也具有较好的效果，平均日增重比对照组提高了2.87%，料重比降低了3.25%[6]。宋海彬等[11]研究发现，在日粮中添加GOD，可提高肉鸡十二指肠和空肠的绒毛高度，降低隐窝深度，增加绒腺比。综合分析发现，两者联合应用的效果优于单独应用，其机制可能为GOD能够通过催化葡萄糖生成挥发性短链脂肪酸，为肠道细胞提供所需能量；乳酸菌进入机体内，能够在肠道内黏附定植，代谢产物有利于肠上皮细胞增殖，改善肉鸡的肠道形态，两者共同促进了肉鸡肠道健康发育。3.2葡萄糖氧化酶和乳酸菌制剂对肉鸡肠道菌群的影响Alpha多样性分析是指一个特定区域或生态系统内的多样性，是反映微生物群落丰富度和多样性的综合指标。通常采用ACE和Chao1指标反应微生物群落丰富度，采用Shannon和Simpson指数估计微生物多样性。Shannon指数越大，说明群落多样性越高；而Simpson指数越大，说明群落多样性越低[12]。本试验中，各试验组ACE和Chao1指数均大于对照组，说明盲肠微生物的丰度增加；各试验组Shannon指数均高于对照组，而Simpson指数均低于对照组，说明盲肠微生物的多样性增加。因此，GOD和乳酸菌制剂以及两者联合应用时，有改善肉鸡盲肠微生物丰度和多样性的趋势。本试验中，肉鸡盲肠微生物门水平上的优势菌群是Firmicutes、Bacteroidetes和Proteobacteria，与Wei等[13]和林奕岑等[14]研究结果相一致；除试验Ⅲ组外，试验Ⅱ组和试验Ⅳ组Bacteroidetes比例极显著和显著升高，Bacteroidetes作为优势菌门在维持宿主的健康中起重要作用，能够预防可能定植和感染肠道的潜在病原体[15]。Proteobacteria是细菌中的一大类门，包括很多病原菌，如大肠杆菌、沙门氏菌、弧菌和罗杆菌等种类。Shin等[16]等表示，Proteobacteria比例增加可能是肠道菌群失衡的标志。本试验中，试验Ⅲ组极显著提高了Proteobacteria的比例，可能是乳酸菌作为肉鸡肠道内的正常菌群，额外添加破坏了肠道菌群平衡，且试验鸡个体存在差异所致。本研究中，在属水平上以Lactobacillus、Clostridium XlVa等为优势菌群，与Lan等[17]的研究结果一致。与对照组相比，试验Ⅳ组Lactobacillus比例提高了5.31%，Escherichia-Shigella的比例也有下降趋势，表明GOD和乳酸菌制剂联合应用对改善肠道菌群结构具有一定的作用。叶帮同[18]研究发现，日粮中添加GOD能够显著降低肉鸡盲肠内大肠杆菌的数量，显著提高盲肠内乳酸杆菌和双歧杆菌的数量。Parabacteroides和Faecalibacterium是动物肠道内重要的菌群之一，前者可能对机体的糖代谢功能具有促进作用，能够降低肥胖、糖尿病等疾病的发生[19]，而Faecalibacterium具有抗炎、改善肠道黏膜屏障、抑制致病菌生长繁殖及肥胖调节作用[20-21]。试验Ⅱ组显著提高了肉鸡肠道内Parabacteroides和Faecalibacterium的比例，可能是GOD为2种菌属的生长繁殖提供了有利条件。但是，各试验组盲肠微生物结构在属水平上的差异性较大，肠道菌群的比例各不相同且可能受到添加剂的种类，添加量、添加方式和饲养环境等众多因素的影响，仍需进一步的研究验证。4结论试验结果表明，GOD和乳酸菌制剂联合应用可提高肠道绒毛高度和V/C值，改善肠道形态。两者联合应用还能够显著提高优势菌群Bacteroidetes的比例，对改善肠道菌群结构也具有一定效果。