贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）是新发现的一种革兰氏阳性好氧细菌，菌体成杆状，在自然界中广泛分布。2008年贝莱斯芽孢杆菌被确定为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）的后期异型体[1-3]。贝莱斯芽孢杆菌可产生较多次级代谢产物[4]（如蛋白酶、纤维素酶、细菌素、脂肽类物质、植物激素等），可以促进植物生长，抑制病原菌，在饲料、医药、食品、植物保护、污水处理和生物防控等[5]领域被广泛研究和应用。本试验从农田土壤中筛选获得1株贝莱斯芽孢杆菌，对该菌株进行形态学及分子生物学鉴定，研究其对金黄色葡萄球菌和产气荚膜梭菌的抑制效果及该菌株自身产蛋白酶、淀粉酶的生物特性，旨在为贝莱斯芽孢杆菌作为潜在饲用芽孢杆菌的研究提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1样品及菌株土壤样品采自北京市通州区漷县村农田。金黄色葡萄球菌CMCC26001（Staphylococcus aureus）购自信阳荣耀生物技术有限公司，产气荚膜梭菌ATCC13124（Clostridium perfringens）购自广东环凯微生物科技有限公司。1.1.2试剂与培养基牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、氯化钠、琼脂等均为国产分析纯试剂。LB培养基：蛋白胨1%、酵母浸粉0.5%、氯化钠1%、琼脂粉2%，121 ℃灭菌20 min。RCM培养基：蛋白胨1%、牛肉膏1%、酵母膏0.3%、葡萄糖0.5%、可溶性淀粉0.1%、氯化钠0.5%、醋酸钠0.5%、L-半胱氨酸盐0.05%、琼脂粉2%，121 ℃灭菌20 min。蛋白酶检测培养基：牛肉膏0.5%、蛋白胨1%、氯化钠0.5%、脱脂奶粉2%、琼脂2%，其中脱脂奶粉单独溶解于115 ℃灭菌20 min，其余成分121 ℃灭菌20 min，混匀，倒板。淀粉酶检测培养基：酵母膏0.5%、蛋白胨1%、可溶性淀粉2%、磷酸氢二钠0.5%、硫酸镁0.01%、氯化钠0.01%、琼脂粉2%，121 ℃灭菌20 min。1.1.3仪器设备SPX-250BF-2恒温培养箱（上海福玛实验设备有限公司）、ZWY-2102C控温摇床（上海智城分析仪器制造有限公司）、SOPTOP-CX40光学显微镜（舜宇光学科技有限公司）、PCR仪（BIO-RAD公司）、DYY6C电泳仪（北京六一仪器厂）、WFH-203B三用紫外分析仪（上海驰唐实业有限公司）、WTL-10K高速台式离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）、TG16K-Ⅱ高速离心机（长沙东旺实验仪器有限公司）。1.2试验方法1.2.1菌株分离初筛：称取1 g碾碎的土壤样品于10 mL无菌生理盐水中，漩涡器振荡混匀，80 ℃水浴30 min；室温冷却，采用稀释涂布法[6]对菌悬液进行10倍梯度稀释至浓度10-9。挑选10-7、10-8、10-9稀释液，各取100 μL菌悬液涂布在LB平板上，每个浓度3个重复，于37 ℃倒置培养24 h，获得单菌落。复筛：以金黄色葡萄球菌为指示菌，取100 μL已活化的指示菌涂布在LB平板上，挑取初筛获得的单菌落点在LB平板上，并对点在涂有指示菌的LB平板上，37 ℃倒置培养24 h。挑选在涂有指示菌的LB平板上出现透明圈的菌株进行保存及后续试验。1.2.2菌株抑菌能力测试指示菌的培养：将金黄色葡萄球菌按照2%的接种量接种在LB培养基中，37 ℃培养24 h；将产气荚膜梭菌按照2%的接种量接种在RCM培养基中，无菌石蜡液封，装入厌氧袋于37℃培养24 h。菌株的活化及培养：将复筛得到的菌株从甘油管中取出在LB平板上进行划线培养，37 ℃培养24 h；培养皿中挑取单菌落接种至液体LB培养基中，37 ℃培养18 h。菌株的抑菌产物粗提：将复筛菌株LB液体培养物，12 000 r/min离心10 min，取上清液过0.22 μm滤膜，即为抑菌产物粗提物，4 ℃保存。打孔法测定抑菌效果：取100 μL金黄色葡萄球菌悬液均匀涂布在LB平板上，采用打孔器打孔，将100 μL抑菌粗提物分别加入孔内，以培养基做对照，将培养皿37 ℃恒温培养24 h，取出，测定抑菌圈直径，评价抑菌活性（以产气荚膜梭菌为指示菌，需涂布于RCM培养基厌氧培养，其余步骤同金黄色葡萄球菌）。1.2.3菌株产酶能力测试利用打孔器在蛋白酶检测培养基、淀粉酶检测培养基上打孔，将筛选菌株LB培养液离心过膜，获得清液，各取100 μL分别加入不同平皿的小孔中，37 ℃培养箱中静置24 h，观察透明圈大小（其中淀粉水解圈需要在平皿上滴加碘液后观察），以此评估筛选菌株产蛋白酶、淀粉酶能力。1.2.4菌株安全性测试将筛选菌株的LB培养液通过打孔法点加在血平板上，37 ℃培养箱中静置24 h，观察有无溶血圈。1.2.5菌株形态学观察筛选获得的菌株，在LB平板上划线，37 ℃培养24 h，自然光下观察菌落形态、质地、颜色等特征；并对菌株革兰氏染色后进行镜检。1.2.6菌株分子生物学鉴定细菌基因组DNA制备：挑取LB平板上已活化的菌株单菌落接种于LB液体培养基，37 ℃摇瓶培养18 h，取1.5 mL菌液，12 000 r/min离心5 min，弃上清，加入1 mL无菌水重悬并离心，重复1次，洗去残余培养基；加入500 μL无菌水吹吸混匀，重悬菌体。加入40 μL 10 g/L溶菌酶与10 μL 1 g/L蛋白酶K混匀，65 ℃孵育30 min，破碎菌体；加入等体积的酚仿抽提液，轻柔混匀，12 000 r/min离心5 min，将上清液移入新离心管中；加入等体积的酚仿抽提液，轻柔混匀，12 000 r/min离心5 min，将上清液移入新离心管中；加入0.8倍体积异丙醇，-80 ℃冰箱中沉降20 min取出，12 000 r/min离心5 min，弃上清，加入300 mL的75%乙醇溶液，12 000 r/min离心5 min，弃上清，重复1次；沉淀在65 ℃晾干，加入35~40 μL无菌水混匀，4 ℃保藏。以提取的基因组DNA为模板，采用细菌通用引物27F：5'-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和1541R：5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'[7]PCR扩增16S rDNA。扩增体系：Premix Taq 10 μL、上下游引物各1 μL、DNA模板0.5 μL、ddH2O 7.5 μL。扩增条件：95 ℃预变性5 min；98 ℃变性10 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸20 s，30个循环；72 ℃终延伸10 min。取2 μL PCR产物，进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，送至天津金唯智生物科技有限公司测序。将菌株16S rDNA的测序结果在NCBI上进行BLAST比对，使用MEGA 5.0软件构建系统发育树，进行1 000次的相似度重复计算[8]。1.3数据统计与分析数据采用Microsoft Excel和SPSS软件进行统计分析，单因素方差分析（One-way ANOVA）进行显著性检验。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1菌株分离结果从农田土壤中筛选菌株，经初筛和复筛后，得到8株对金黄色葡萄球菌有抑制作用的菌株，分别为N-3、N-4、N-5、N-6、N-8、N-11、N-12、N-13、N-19、N-20、N-21、N-25。2.2筛选菌株抑菌能力的测定结果（见表1）由表1可知，筛选菌株对金黄色葡萄球菌和产气荚膜梭菌均具有抑制作用，其中N-3、N-19、N-20、N-21、N-25的滤液对金黄色葡萄球菌的抑制作显著高于其他菌株（P0.05），抑菌圈直径为16~17 mm。N-3、N-4、N-5、N-6滤液对产气荚膜梭菌的抑制作用显著高于其他菌株（P0.05），N-3抑菌圈直径达17 mm。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.02.017.T001表1筛选菌株抑菌能力的测定结果菌株名称指示菌的抑菌圈直径金黄色葡萄球菌产气荚膜梭菌N-317.26±0.13*17.02±0.21*N-46.08±0.0810.30±0.05*N-57.32±0.3510.23±0.19*N-66.40±0.2110.41±0.15*N-88.17±0.116.24±0.28N-117.18±0.257.33±0.08N-127.05±0.158.12±0.11N-136.23±0.167.34±0.27N-1916.36±0.09*6.38±0.20N-2017.02±0.17*7.19±0.05N-2117.41±0.20*7.30±0.13N-2516.05±0.12*6.08±0.05注：*表示同列数据差异显著（P0.05），下表同。mm2.3筛选菌株产酶能力的测定结果（见表2）由表2可知，筛选菌株均具有一定的产蛋白酶、淀粉酶功能，其中N-6产蛋白酶的能力显著高于其他菌株（P0.05），蛋白水解圈直径为10.05 mm。N-3、N-19、N-20、N-21、N-25产淀粉酶的能力显著高于其他菌株（P0.05），N-3淀粉水解圈直径达15.31 mm。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.02.017.T002表2筛选菌株产酶能力的测定结果菌株名称透明圈直径蛋白酶淀粉酶N-38.21±0.0515.31±0.21*N-48.16±0.175.25±0.05N-55.28±0.126.19±0.26N-610.05±0.15*6.41±0.37N-84.32±0.188.07±0.19N-117.26±0.258.25±0.01N-126.31±0.117.23±0.27N-138.08±0.028.15±0.23N-195.37±0.1711.07±0.15*N-205.03±0.1411.18±0.02*N-215.20±0.0712.36±0.14*N-255.05±0.2212.00±0.05*mm2.4筛选菌株溶血性的测定结果（见图1）由图1可知，筛选菌株中仅N-4、N-6出现和阳性对照一样的溶血圈，其余筛选菌株均未出现溶血圈，表明这些菌株具有一定的安全性。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.02.017.F001图1筛选菌株溶血性的测定结果2.5菌株形态学观察结果（见图2）综合上述试验结果，选定筛选菌株N-3按照1.2.5方法进行形态学观察。由图2（a）可知，菌株N-3在LB平板上，其菌落呈浅黄色、圆形、表面褶皱干燥、不透明、边缘不整齐。由图2（b）可知，菌株N-3染色，镜检后，结果为革兰氏阳性，菌体呈杆状，单个或成对排列。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.02.017.F002图2筛选菌N-3的形态学鉴定结果（a） 菌落形态 （b） 革兰氏染色镜检结果2.6菌株分子生物学鉴定结果对菌株N-3进行基因组DNA提取后，利用通用引物27F和1541R对其进行PCR扩增。将PCR产物通过1%琼脂糖凝胶电泳，筛选菌N-3的PCR扩增电泳结果见图3。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.02.017.F003图3筛选菌N-3的PCR扩增电泳结果注：M为DL5 000 DNA Marker；1为筛选菌株N-3；N为阴性对照。由图3可知，N-3菌株16S rDNA的PCR扩增产物长度为1 462 bp，符合预期目的条带大小。将N-3菌株16S rDNA基因片段测序结果在NCBI上进行BLAST比对。通过MEGA 5.0软件对该菌株构建系统发育树，筛选菌N-3的系统发育树见图4。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.02.017.F004图4筛选菌N-3的系统发育树由图4可知，N-3菌株与贝莱斯芽孢杆菌的同源性较接近，结合形态学观察将该菌株鉴定为贝莱斯芽孢杆菌。3讨论贝莱斯芽孢杆菌能够产生丰富的次级代谢产物，包括酶、抗菌物质和植物激素等。贝莱斯芽孢杆菌的抗菌物质主要有抗菌蛋白（蛋白酶、β-葡聚糖酶等）、脂肽类化合物（表面活性素、伊枯草菌素和芬荠素）、聚酮类化合物[9]。徐淑琴等[10]从藏羊瘤胃中分离获得的贝莱斯芽孢杆菌对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和产气荚膜梭菌均具有抑制作用，其中对产气荚膜梭菌的抑制能力最强，与本试验结果一致。邓丽等[11]研究发现，贝莱斯芽孢杆菌粗提物通过破坏病原菌细胞膜完整性、抑制多糖合成，从而降低金黄色葡萄球菌的细胞成活率，有助于本试验后续对贝莱斯芽孢杆菌抑菌机制的研究。贝莱斯芽孢杆菌丰富的胞外酶系包含纤维素酶、淀粉酶[12]、蛋白酶、过氧化氢酶和氧化酶等。缪伏荣等[8]从废弃茶渣中分离获得的贝莱斯芽孢杆菌Fb可以产生具有较强酶活力的纤维素酶和蛋白酶。钟丽娟等[13]从肉鸡肠道中分离筛选到1株高产淀粉酶和纤维素酶的贝莱斯芽孢杆菌CY-03。王帅等[14]从土壤中分离获得的贝莱斯芽孢杆菌S-3可以产较高水平的蛋白酶。刘安等[15]验证了贝莱斯芽孢杆菌P9具有分泌纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶、β-葡聚糖酶的能力。本试验筛选的N-3菌株性能同上述研究中的菌株相似，具有良好的产蛋白酶、淀粉酶特性，说明N-3菌株具有帮助动物机体消化饲料的潜力。贝莱斯芽孢杆菌因其良好的抑菌能力和产酶特性，在饲料添加剂领域具有广阔的应用前景[16]。刘韶娜等[17]在猪饲粮中添加贝莱斯芽孢杆菌，结果发现，添加贝莱斯芽孢杆菌可以改善猪粪便菌群的结构，提高有益菌的相对丰度，降低致病菌的相对丰度。叶淼[18]在蛋鸡饲料中添加不同剂量的贝莱斯芽孢杆菌菌剂具有替抗的效果。孙长超等[19]通过短期灌喂大鼠贝莱斯芽孢杆菌M2，结果发现，大鼠的脂代谢、免疫力和肠道菌群丰度均得到有益调控。贝莱斯芽孢杆菌具有作为益生菌应用在饲料养殖行业的潜质。唐萍等[20]对贝莱斯芽孢杆菌进行生物安全评价，结果发现，贝莱斯芽孢杆菌在血平板上无溶血现象，与本试验研究结果一致，说明贝莱斯芽孢杆菌N-3具有一定的安全性，但N-3作为益生菌饲料添加剂的候选菌株仍需选择多种药物进行药敏试验加以研究。4结论试验从农田土壤中筛选获得菌株N-3，经形态学和分子生物学鉴定，确定该菌株为贝莱斯芽孢杆菌。该菌株对金黄色葡萄球菌和产气荚膜梭菌具有较强的抑制作用，具有良好的产蛋白酶、淀粉酶特性，无溶血性，较安全可靠。