花生是主要油料作物之一。我国花生种植主要集中在山东、河南、河北等省[1]，年产量约1 000万t，约占全球花生生产总量的38%。花生粕是花生经过压榨提油后的副产品，气味清香，富含天冬氨酸、谷氨酸等多种氨基酸[2]，蛋白含量高达48%，胆固醇和抗营养因子含量相对较低。因此，加强花生粕饲用价值的开发对资源充分利用具有重要意义。花生粕虽可以直接饲喂动物，但由于氨基酸组成不平衡[3]，且赖氨酸含量比豆粕低[4]，需要额外添加氨基酸才能够满足动物生产的需求。花生粕极易受霉菌污染，导致花生粕的饲用品质下降，具有危害动物健康，降低生产性能的风险[5]。目前，对花生粕进行生物发酵处理是加强花生粕饲用价值和改善饲用品质的重要方式，可以提高饲料中部分营养成分的含量，去除饲料中的抗营养因子，还可以将蛋白有效转化为多肽，提高饲料的利用率[6]。花生粕在发酵过程中能够积累有益菌，抑制病原微生物繁殖，改善肠道功能，有效延长花生粕饲料的贮存时间[7]。因此，本研究以枯草芽孢杆菌为发酵菌种对花生粕进行固态发酵，以发酵花生粕中多肽含量为指标，对微生物接种量、发酵温度、发酵时间、培养基含水量等因素进行考察，旨在研究最佳发酵工艺条件，为花生粕在动物生产中的应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料花生粕购自江苏恒益粮油有限公司。过60目筛，发酵前测定多肽含量。枯草芽孢杆菌（活菌数≥2×1010 CFU/g）购自江苏绿科生物技术有限公司。1.2试剂与仪器本研究使用的试剂除特殊注明外，均为分析纯。试剂均购自中国标准物质网。主要试剂：150 g/L三氯乙酸、盐酸（优级纯）、硫酸、硫酸铜、硫酸钾、硼酸溶液、400 g/L的氢氧化钠溶液、硫酸标准滴定溶液、混合指示剂、混合氨基酸标准液（0.002 5 mol/L）。l g/L甲基红乙醇溶液与l g/L漠甲酚绿乙醇溶液按照5∶1比例临用时混合。pH值2.2的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6 g柠檬酸钠，加入16.5 mL浓盐酸，加水稀释至1 000 mL，调节pH值至2.2。pH值3.3的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6 g柠檬酸钠，加入12 mL浓盐酸，加水稀释至1 000 mL，调节pH值至3.3。pH值6.4的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6 g柠檬酸钠和46.8 g氯化钠（优级纯），加水溶解并稀释至1 000 mL，调节pH值至6.4。pH值5.2的乙酸锂溶液：称取氢氧化锂168 g，加入冰乙酸（优级纯）279 mL，加水稀释至1 000 mL，调节pH值至5.2。茚三酮溶液：取150 mL二甲基亚砜和50 mL乙酸锂溶液，加入4 g水合茚三酮和0.12 g还原茚三酮，搅拌至完全溶解。主要仪器：LC40高效液相色谱仪（岛津）、UV-5200紫外分光光度计（上海元析仪器有限公司）、1L-200L真空抽滤脱气装置（上海科兴仪器有限公司）、L-3000氨基酸自动分析仪（苏州华美辰仪器设备有限公司）、FY-KDN-AS定氮蒸馏装置（杭州菲跃仪器有限公司）。1.3测定指标及方法花生粕中的多肽检测方法参照GB/T 22492—2008《大豆肽粉》。样品中多肽含量计算方法为：X=X1-X2 (1)式中：X为样品中多肽的含量（%）；X1为样品中酸溶蛋白质的含量（%）；X2为样品中游离氨基酸的含量（%）。1.4试验方法1.4.1单因素试验初始发酵工艺：将100 kg花生粕饲料置于发酵罐中，接种30 g枯草芽孢杆菌，充分混匀，密封，34 ℃培养24 h。发酵后风干，检测发酵花生粕饲料中多肽含量。基于初始发酵条件，采用单因素轮换法分别研究枯草芽孢杆菌接种量（30、60、90、120、150、180 g）、发酵温度（30、32、34、36、38、40 ℃）、发酵时间（12、24、36、48、60、72 h）对发酵花生粕中多肽含量的影响。1.4.2正交试验根据单因素试验结果，筛选各项因素最佳范围，设计以枯草芽孢杆菌接种量、发酵温度、发酵时间3因素3水平的正交试验。以发酵花生粕中多肽含量最高为优化指标，得出最佳的固态发酵工艺参数。L9(34)正交试验因素水平设计见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.02.016.T001表1L9（34）正交试验因素水平设计水平枯草芽孢杆菌接种量/(g/kg)发酵温度/℃发酵时间/h190344821203660315038721.5数据统计与分析数据采用Excel进行初步整理，采用SPSS软件进行分析。本研究对每个发酵条件下花生粕中多肽含量重复测定6次，结果以平均值表示。2结果与分析2.1未发酵花生粕中多肽含量（见表2）由表2可知，多肽含量平均值为6.55%，变异系数未超过5%，说明本研究所使用的豆粕初始多肽含量稳定，能够保证后续试验的结果可靠。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.02.016.T002表2未发酵花生粕中多肽含量项目123456平均值CV多肽含量6.486.926.376.566.426.536.552.73%2.2单因素试验2.2.1枯草芽孢杆菌接种量对发酵花生粕中多肽含量的影响（见图1）由图1可知，随着枯草芽孢杆菌接种量的增多，发酵花生粕中多肽含量逐渐提升。当枯草芽孢杆菌接种量达120 g时，发酵花生粕中多肽含量达到最高为15.89%。此后，随枯草芽孢杆菌含量的提高，多肽含量呈下降趋势。因此，枯草芽孢杆菌的最佳接种量处于90~150 g范围内。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.02.016.F001图1枯草芽孢杆菌接种量对发酵花生粕中多肽含量的影响2.2.2发酵温度对发酵花生粕中多肽含量的影响（见图2）由图2可知，随着温度的升高，发酵花生粕中多肽含量逐渐上升。温度为36 ℃时，多肽含量最高为14.33%。随后，随着温度的升高，多肽含量逐渐降低。因此，枯草芽孢杆菌最佳发酵温度处于34~38 ℃范围内。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.02.016.F002图2发酵温度对发酵花生粕中多肽含量的影响2.2.3发酵时间对发酵花生粕中多肽含量的影响（见图3）由图3可知，发酵花生粕中多肽含量随着发酵时间的提高而上升，在60 h时达到最高，为16.87%。随后，随着温度的提高而呈下降趋势。因此，最佳发酵时间处于48~72 h范围内。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.02.016.F003图3发酵时间对发酵花生粕中多肽含量的影响2.3正交试验结果正交试验结果与极差分析见表3，方差分析结果见表4。由表3可知，3种因素的主次顺序为：发酵温度发酵时间枯草芽孢杆菌接种量。由表4可知，在枯草芽孢杆菌接种量在最佳添加范围内时，对发酵花生粕中多肽含量无显著影响，而发酵温度对多肽含量具有极显著影响（P0.01），发酵时间对多肽含量具有显著影响（P0.05），与极差分析结果一致。因此，枯草芽孢杆菌固态发酵花生粕的最优发酵参数为：枯草芽孢杆菌接种量150 g、发酵温度38 ℃、发酵时间60 h。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.02.016.T003表3正交试验与极差分析结果项目枯草芽孢杆菌接种量/g发酵温度/℃发酵时间/h多肽含量/%1150.0038.0048.0016.91290.0036.0072.0017.623150.0034.0072.0013.95490.0038.0060.0018.455120.0038.0072.0018.226150.0036.0060.0018.677120.0036.0048.0014.228120.0034.0060.0013.61990.0034.0048.0010.35K146.4237.9141.48K246.0550.5150.73K349.5353.5849.79k115.4712.6413.83k215.3516.8416.91k316.5117.8616.60R1.165.223.0810.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.02.016.T004表4正交试验方差分析结果项目Ⅲ型平方和自由度均方F值P值校正模型65.70610.9555.470.018截距2 240.7612 240.7611 350.730.000混合菌剂接种量2.4521.236.210.139发酵温度46.01223.01116.540.009发酵时间17.2428.6243.660.022误差0.3920.20校正的变异2 306.869在最优发酵条件下对花生粕进行发酵，最佳发酵参数条件下花生粕中多肽含量见表5。由表5可知，发酵花生粕多肽含量平均为19.31%，比未发酵花生粕中多肽含量高194.81%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.02.016.T005表5最佳发酵参数条件下花生粕中多肽含量项目123456平均值多肽含量19.3119.4219.5719.2019.3319.2819.31%3讨论3.1花生粕发酵工艺的优化研究花生粕发酵处理是提高花生粕饲用价值的重要方法，可以提高饲料消化利用率，改善动物的生产性能[8]，但不同研究对花生粕发酵所使用的优化目标不完全一致。邱天宇等[9]使用黑曲霉生物发酵对花生粕进行脱毒，考察接种量、料液比、发酵时间、发酵温度4个因素对黄曲霉素（AFB1）和黄曲霉毒素总量（AFT）降解的影响，并优化发酵工艺，结果表明，最佳条件为接种量9.28%、发酵温度31.80 ℃、发酵时间63.30 h、料液比1∶1.56，花生粕中AFB1降解率高达95.01%，总AFT脱除率高达72.90%。王增元等[10]使用植物乳杆菌、酿酒酵母和枯草芽孢杆菌对花生粕进行发酵，以发酵花生粕中多肽含量和总酸含量为优化目标，对接种量、发酵温度、发酵时间和料液比进行考察，结果表明，最佳工艺参数为植物乳杆菌接种量5%、酿酒酵母接种量9%、枯草芽孢杆菌接种量9%、料液比1∶1.2、发酵温度37 ℃、发酵时间48 h，在此条件下发酵花生粕中多肽含量为18.89%，总酸含量为9.12。在王增元等[10]的研究中，综合考虑多肽与总酸两项指标，在其正交试验中多肽含量最高可达21.59%，说明混合菌种对提高花生粕中多肽含量的效果比单一使用枯草芽孢杆菌效果更好。杨新建等[11]以发酵花生粕多肽含量为研究对象，研究不同微生物对其含量的影响，结果表明，米曲霉多肽产量最高，产朊假丝酵母和地衣芽孢杆菌，但考虑多肽的稳定性后认为地衣芽孢杆菌最适合制备多肽。本研究未考察不同的微生物对花生粕多肽含量的影响，后续可进行深入研究。3.2发酵花生粕在动物养殖中的应用前景功能性植物多肽是饲料添加剂开发的重要方向。植物多肽可以调节动物机体免疫[12]，强化生理规律调节[13]，促进动物生长发育[14]，提高动物采食量[15]，影响畜禽产品品质[16]。魏明秀[17]通过微生物发酵制备花生粕功能性短肽，结果发现，该功能性短肽具有清除羟自由基、DPPH自由基和超氧阴离子的功能，并且具有较好的吸油性，可以作为抗氧化剂。刘英丽等[18]使用酶解花生粕以制备抗氧化肽，结果表明，在底物质量分数为7%、酶添加量为2%、pH值8.0、温度65 ℃、酶解4 h条件下，花生粕多肽水解度为14.86%，DPPH清除率高达55.31%。陈晓芸等[19]研究发现，花生粕多肽可以延长生物寿命和使用年限，增强机体抗氧化能力。张惠雯[20]研究发现，花生粕多肽可以改善动物脂质代谢，改善动物肠道健康。因此，发酵花生粕在动物养殖中具有广阔的应用前景。4结论本试验条件下，以花生粕多肽含量为指标，使用枯草芽孢杆菌进行固态发酵的最佳工艺参数为：枯草杆菌接种量为150 g、发酵温度为38 ℃、发酵时间为60 h。在最优发酵参数条件下，发酵花生粕中多肽含量为19.31%，比未发酵花生粕饲料中多肽含量高194.81%。但本研究仍存在一定的局限性，在后续的花生粕多肽开发中会进一步研究水和不同微生物对发酵花生粕多肽含量的影响。