“无抗时代”的到来给畜牧养殖业带来新的挑战，寻找优质、高效、安全的替抗产品是推动畜牧养殖业健康发展的关键。微生态制剂是由具有益生功能活菌制剂制备的安全可靠的饲料添加剂，是极具潜力的替抗产品之一。肠道作为动物机体养分消化和吸收的主要代谢场所，也是机体发挥防御和免疫功能最重要的器官，肠道表面寄生的微生物构筑了肠道的第一道生物屏障。丁酸梭菌（Clostridium butyricum）是革兰氏阳性菌中的一种厌氧的芽孢杆菌，抗逆性强，能够耐高温、酸性条件以及多种抗生素[1]。丁酸梭菌的代谢产物具有抑菌、促生长、调节肠道健康等多种功能[2-4]。屎肠球菌（Enterococus Faecium）代谢会产生乳酸，是一种公认的抗逆性较强的益生乳酸菌，能够抑制病原菌在动物肠道内的黏附和增殖，改善动物肠道健康状况，进而提高动物生长和生产水平[5-6]。丁酸梭菌[7]和屎肠球菌作为绿色、高效的新型饲料添加剂，在饲料和畜牧生产中已经被广泛应用，但多数是作为单一益生菌使用，关于丁酸梭菌和屎肠球菌的复配使用的报道较少。本试验以产蛋高峰期的海兰褐蛋鸡为研究对象，在饲粮中添加不同水平的复合微生态制剂，研究复合微生态制剂对产蛋高峰期蛋鸡的产蛋性能、蛋品质、血清生化指标和肠道形态的影响，为微生态制剂在蛋鸡生产中的应用和替抗产品研发提供参考。1材料与方法1.1试验设计选用体重和产蛋率接近的健康的40周龄海兰褐蛋鸡400只，随机分成4组，每组5个重复，每个重复20只鸡。对照组饲喂玉米-豆粕型基础饲粮，抗生素组在基础饲粮基础上添加200 g/t的金霉素（50%），试验1组和2组分别在基础饲粮中添加50 g/t和100 g/t复合微生态制剂。复合微生态制剂购自武汉新华扬生物股份有限公司，主要成分为屎肠球菌（有效活菌数为5.0×109 CFU/g）和丁酸梭菌（有效活菌数为1.0×108 CFU/g）。1.2基础饲粮与饲养管理基础饲粮参照中国鸡饲养标准（2004）配制产蛋高峰期蛋鸡玉米-豆粕型基础饲粮，基础饲粮组成及营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.02.009.T001表1基础饲粮组成及营养水平（风干基础）原料组成含量/%营养水平合计100玉米63代谢能/(MJ/kg)11.23豆粕24粗蛋白/%16.30石粉8赖氨酸/%0.84预混料5蛋氨酸/%0.41钙/%3.59有效磷/%0.35注：1.预混料为每千克饲粮提供：VA 3 000 IU、VD3 2 400 IU、VE 16 IU、VK3 2 mg、硫胺素1.6 mg、核黄素6.5 mg、烟酸28 mg、氯化胆碱450 mg、泛酸钙9 mg、吡哆醇3.25 mg、生物素0.07 mg、叶酸0.8 mg、氰钴胺素0.015 mg、铁267.5 mg、铜13 mg、锰95 mg、锌90 mg、碘1.35 mg、硒0.29 mg。2.营养水平均为计算值。试验蛋鸡采用三层层叠笼养（5只/笼，4笼/重复），采用人工光照（光照强度10~15 LX）和自然光照相结合的方式，每天保持15 h光照（5：00~20：00），机械通风+自然通风，室温15~20 ℃，湿度40%~60%。每天饲喂2次（7：30和15：30），喂料量以每天基本不剩料为标准；定期清理粪便。试验正式开始前进行预试验，采用试验饲粮按比例逐步替代基础饲粮，观察预试验期间各处理组蛋鸡的产蛋率。整个试验期间蛋鸡均为自由采食，保证充足饮水。试验期42 d。1.3测定指标及方法1.3.1样品采集试验第42 d 16：30，每个重复随机取两枚鸡蛋做好标记，用于检测蛋品质。试验第43 d 7：00，断水2 h，从各重复中随机抓取1只蛋鸡，左翅静脉采血4 mL，3 000 r/min离心10 min制备血清，将上层血清分装于1.5 mL的EP管中，-20 ℃保存，用于检测血清生化相关指标；处死，打开腹腔，分离各组织，剪取空肠、回肠、盲肠中段相同位置1~2 cm的肠段，放入4%多聚甲醛固定液中固定，用于制作组织切片。1.3.2产蛋性能每天10：00~10：30、16：00~16：30时间段内捡蛋，做好标记。记录各个重复的产蛋个数、总蛋重、投料量、剩余料量、存栏鸡数，计算各个重复的平均蛋重、产蛋率（包括破损蛋）、平均日采食量、料蛋比（包括破损蛋）。产蛋率=各重复总产蛋数/(试验天数×各重复总存栏鸡数)×100%(1)平均蛋重=各重复总蛋重/各重复总产蛋数(2)平均日采食量=Σ[(每天投料量-每天余料量)/当天存栏鸡数]/饲养天数(3)料蛋比=各重复总耗料量/各重复总蛋重(4)破次蛋率=各重复破次蛋数/各重复总蛋数×100%(5)1.3.3蛋品质1.3.3.1蛋形指数使用游标卡尺测量蛋的纵径和最大横径，精确至0.01 mm。蛋形指数=纵径/横径(6)1.3.3.2哈夫单位使用游标卡尺测量蛋黄周围距离蛋黄1 cm处3个位置的浓蛋白的高度，取平均值，计算哈夫单位。哈夫单位=100×Log[H+7.57-1.7×w0.37](7)式中：H为浓蛋白高度平均值（mm）；w为鸡蛋重量（g）。1.3.3.3蛋壳比重蛋壳比重=蛋壳重/蛋重×100% (8)1.3.3.4含水量采用蛋黄分离器分离蛋清和蛋黄，装入已烘干称重的培养皿中，分别称重，放入恒温鼓风干燥箱中，50~53 ℃过夜烘干，放入干燥器中冷却，称重。蛋清/蛋黄含水量=(蛋清/蛋黄湿重-蛋清/蛋黄烘干重)/(蛋清/蛋黄烘干重)×100%(9)1.3.3.5蛋清、蛋黄中蛋白质含量完全分离鸡蛋的蛋清液和蛋黄液，使用微量移液器吸取分离后的液体至消化管中，加入适量浓硫酸，使用FOSS消化炉消化，采用凯氏定氮仪（丹麦福斯分析仪器有限公司）定氮，采用已标定的标准盐酸溶液进行滴定，根据消耗的盐酸体积和盐酸浓度计算样品中粗蛋白含量。蛋清/蛋黄粗蛋白含量=c×v×14×6.25×100%/m (10)式中：c为标准盐酸溶液浓度（mol/L）；v为消耗的标准盐酸溶液体积（mL）；14为氮的分子质量；6.25为将氮元素换算成粗蛋白质量的系数；m为蛋清液或蛋黄液的质量（g）。1.3.3.6脂肪含量鸡蛋煮熟，冷却，完全剥离蛋黄和蛋清，准确称量蛋黄重，将蛋黄搅碎拌匀，称取样品放入滤纸筒中，105 ℃恒温干燥箱，干燥3.5 h，放入称好重的盛醚杯中，采用SOX-406索氏脂肪测定仪（海能仪器有限公司）进行脂肪抽提，60 ℃抽提7 h，取出盛醚杯，105 ℃恒温干燥箱干燥3.5 h，称重，计算脂肪含量。脂肪含量=(m1-m0)×M1/(M2×M0)×100%(11)式中：m1为脂肪抽提后烘干盛醚杯重（g）；m0为抽提前烘干盛醚杯重（g）；M1为蛋黄重（g）；M2为蛋黄称样重（g）；M0为蛋重（g）。1.3.3.7蛋黄比重采用蛋黄分离器小心分离蛋清和蛋黄，收集蛋黄称取重量。蛋黄比重=蛋黄重/全蛋重×100%(12)1.3.4血清生化指标采用试剂盒（南京建成生物工程研究所）和Epoch酶标仪（美国伯腾仪器有限公司）测定血清中总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、葡萄糖（GLU）、尿酸（UA）、尿素氮（BUN）含量。球蛋白(GLB)=总蛋白-白蛋白(13)1.3.5肠道形态取出甲醛中固定的十二指肠、空肠、回肠肠段，采用石蜡包埋，采用常规的苏木精-伊红（HE）染料对连续切片（5 mm）染色。切片在光镜下观察测量，从每张切片中随机选取15根绒毛，分别测定每根绒毛的高度和绒毛下隐窝的深度。观察肠道形态，根据绒毛高度与隐窝深度计算两者之间的比值，记为V/C。1.4数据统计与分析试验数据采用Excel 2016进行整理和分析计算，采用SPSS 16.0软件中的One-way ANOVA程序对数据进行单因素方差分析，Duncan's法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1复合微生态制剂对蛋鸡产蛋性能的影响（见表2）由表2可知，与对照组相比，抗生素组、试验1组和试验2组蛋鸡的产蛋率显著提高（P0.05），分别提高了2.78%、3.02%和3.27%；鸡蛋破次蛋率显著降低（P0.05），分别降低了49.52%、65.71%和72.38%；与对照组相比，试验1组和试验2组蛋鸡的料蛋比显著降低（P0.05），分别降低了4.48%、5.83%，但试验1组和试验2组间差异不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.02.009.T002表2复合微生态制剂对蛋鸡产蛋性能的影响组别产蛋率/%平均日采食量/[g/(只·d)]平均蛋重/g料蛋比破次蛋率/%对照组90.13±1.30b117.49±2.8758.24±0.592.23±0.06a1.05±0.23a抗生素组92.64±1.16a117.06±2.1458.96±1.382.16±0.08ab0.53±0.18b试验1组92.85±1.45a118.01±2.7159.15±1.162.13±0.06b0.36±0.14b试验2组93.08±1.66a116.50±1.5259.25±0.832.10±0.06b0.29±0.11b注：同列数据肩标不同小写字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。2.2复合微生态制剂对蛋鸡蛋品质的影响（见表3）由表3可知，与对照组相比，试验1组的鸡蛋的哈夫单位显著提高了5.47%（P0.05），鸡蛋的蛋黄粗蛋白含量显著提高了5.32%（P0.05）。与对照组相比，试验2组鸡蛋的蛋黄比重显著提高了7.05%（P0.05）；鸡蛋的蛋黄水分显著降低了3.21%（P0.05）；鸡蛋的脂肪含量显著提高了8.29%（P0.05）；鸡蛋的蛋黄粗蛋白含量显著提高了6.69%（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.02.009.T003表3复合微生态制剂对蛋鸡蛋品质的影响组别蛋型指数蛋黄比重/%蛋壳比重/%哈夫单位蛋清水分/%蛋黄水分/%脂肪含量/%蛋清粗蛋白含量/%蛋黄粗蛋白含量/%对照组1.32±0.0627.64±1.25b10.13±0.2173.17±1.87b87.55±0.5245.81±0.35a8.08±0.47b9.34±0.2216.74±0.38b抗生素组1.31±0.1928.72±1.19ab10.07±0.2474.69±2.04ab87.27±0.3444.94±0.72ab8.19±0.36ab9.66±0.3217.22±0.45ab试验1组1.32±0.0528.54±0.97ab10.38±0.1577.17±1.49a87.04±0.7044.76±0.61ab8.31±0.23ab9.83±0.4117.63±0.47a试验2组1.33±0.0629.59±1.04a10.46±0.3377.38±2.12a86.87±0.5344.34±0.36b8.75±0.35a9.94±0.3217.86±0.39a2.3复合微生态制剂对蛋鸡血清生化指标的影响（见表4）由表4可知，与对照组相比，试验2组蛋鸡血清中TP含量显著提高了6.30%（P0.05）；蛋鸡血清中GLB含量显著提高了9.19%（P0.05）；蛋鸡血清中UA含量显著降低了32.51%（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.02.009.T004表4复合微生态制剂对蛋鸡血清生化指标的影响组别TP/(g/L)ALB/(g/L)GLB/(g/L)GLU/(mmol/L)TG/(mmolL)TC/(mmol/L)BUN/(mg/L)UA/(µmol/L)对照组48.12±2.19b23.27±0.3925.04±1.86b13.96±0.4213.26±1.3412.41±1.0111.2±0.21467.47±61.47a抗生素组48.82±1.72ab23.53±0.6425.29±2.01ab14.35±0.7113.89±1.5911.99±1.248.9±0.27416.58±41.96ab试验1组49.13±1.39ab23.91±1.0525.28±0.48ab14.14±0.8714.19±1.7812.16±1.229.3±0.32327.63±57.62b试验2组51.15±1.52a23.95±1.1427.34±1.03a14.43±0.7714.51±1.2912.34±1.158.8±0.29315.49±47.90b2.4复合添加微生态制剂对蛋鸡肠道形态的影响（见表5）由表5可知，与对照组相比，试验1组和试验2组蛋鸡的空肠绒毛高度分别显著提高了8.72%、9.63%（P0.05），空肠V/C值分别显著提高了16.17%、15.72%（P0.05）；蛋鸡的回肠绒毛高度分别显著提高了18.28%、20.64%（P0.05），回肠隐窝深度分别显著降低了18.13%、16.51%（P0.05），回肠V/C值分别显著提高了43.32%、43.68%（P0.05）；蛋鸡的盲肠绒毛高度分别显著提高了22.25%、25.48%（P0.05），盲肠绒V/C值分别显著提高了34.45%、44.54%（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.02.009.T005表5复合微生态制剂对蛋鸡肠道形态的影响组别空肠回肠盲肠绒毛高度/μm隐窝深度/μmV/C绒毛高度/μm隐窝深度/μmV/C绒毛高度/μm隐窝深度/μmV/C对照组875.19±44.56b199.55±12.274.39±0.23b507.22±58.16b185.72±20.76a2.77±0.53b242.52±28.97b204.13±14.82ab1.19±0.16b抗生素组867.41±45.94b204.15±17.244.28±0.49b490.77±40.34b212.81±32.05a2.33±0.29b188.51±21.08c222.94±26.45a0.85±0.12c试验1组951.47±53.37a187.32±10.995.10±0.47a599.93±51.25a152.05±12.07b3.97±0.51a296.47±19.84a185.71±12.36b1.60±0.16a试验2组959.46±44.70a189.96±18.365.08±0.47a611.90±41.75a155.06±12.21b3.98±0.57a304.32±17.07a178.50±23.10b1.72±0.19a3讨论3.1复合微生态制剂对蛋鸡产蛋性能的影响动物对饲料的消化利用和动物肠道菌群组成决定动物的生长和健康。丁酸梭菌具备很强的耐酸、耐盐性，可以在动物肠道内很好地定植和生长，其代谢产生的短链脂肪酸——丁酸，能够刺激小肠胰酶的分泌，进而促进小肠内养分的消化吸收。丁酸梭菌代谢过程中生成的一些其他的短链脂肪酸，如乙酸、丙酸等，有助于刺激肠道蠕动[7]。研究表明，丁酸梭菌在其代谢进程中会分泌多种酶类，如淀粉酶、纤维素酶等，此外还有一些维生素产生，如B族和K族维生素等，这些物质对改善消化环境、提高营养物质吸收效率有很好的促进作用[3]。研究表明，饲粮中添加一定水平的丁酸梭菌制剂有助于提高蛋鸡的产蛋率[8]，对产蛋后期海兰褐蛋鸡的产蛋率也有显著改善效果[9]。屎肠球菌是一种兼性厌氧菌，对高温、酸性条件和胆盐均具有很强的耐受性[10]。屎肠球菌具有极强的黏附能力，能够紧密附着在动物肠道表面，形成一层保护屏障，从而维持肠道健康[11]；其代谢过程中产生的一些营养物质，如氨基酸、维生素等，可参与动物机体内的物质代谢过程中，促进机体生长。屎肠球菌代谢过程中会产生一些抑菌性功能性物质，如乳酸、过氧化氢和细菌素等，对遏制致病菌对肠道的入侵和在肠道内的繁殖具有重要作用[6]。研究表明，在蛋鸡饲粮添加屎肠球菌制剂能够显著降低蛋鸡的料蛋比以及破蛋率[12]。本研究中，蛋鸡饲粮添加不同水平由丁酸梭菌和屎肠球菌组成的复合微生态制剂能够显著提高产蛋高峰期蛋鸡的产蛋率，降低蛋鸡的料蛋比以及破次蛋率，与上述研究结果相似。3.2复合添加微生态制剂对蛋鸡蛋品质的影响蛋品质包括鸡蛋的形状、大小、清洁度、蛋壳强度以及内容物等指标，如蛋清黏稠度、蛋黄大小和色泽、脂肪含量等，蛋品质能够反映鸡蛋的新鲜度和食用品质。蛋黄占全蛋的比例可以衡量蛋品质，其数值越大，蛋品质越好。哈夫单位是目前用于评定蛋品质的主要指标之一，可以衡量蛋类产品的新鲜程度以及蛋白品质。研究表明，益生菌有助于改善蛋鸡蛋品质。蛋鸡饲粮中添加复合微生态制剂，可以显著提高鸡蛋蛋白高度和哈夫单位[13-14]，提高蛋壳厚度，改善鸡蛋品质[15]。张秀江等[9]研究发现，蛋鸡饲粮中添加一定水平的丁酸梭菌制剂，能够显著提高蛋黄的相对重量，对哈夫单位也有一定的改善。饲粮中添加0.05%的枯草芽孢杆菌制剂，能够降低鸡蛋的软破壳蛋率，改善蛋黄颜色[16]。丁酸梭菌和屎肠球菌均是肠道益生菌，其代谢产生的乳酸、丁酸等短链脂肪酸，能够降低胃肠道内pH值，抑制一些致病菌的定植和生长，改善肠道健康。丁酸梭菌和屎肠球菌代谢产生的各种酶类、维生素等，能够提高动物对养分的消化利用率，增强营养物质在肉蛋产品中的沉积，进而改善蛋品质。本试验结果显示，饲粮添加由丁酸梭菌和屎肠球菌组成的复合微生态制剂能够显著提高鸡蛋的蛋黄比重、哈夫单位、脂肪含量和蛋黄粗蛋白含量，与上述的研究结果相似，表明本研究中的复合微生态制剂有助于改善鸡蛋蛋品质。3.3复合微生态制剂对蛋鸡血清生化指标的影响血清总蛋白含量能够反映动物体内蛋白质的代谢变化，血清蛋白在维持渗透压和pH值、运输多种代谢物、免疫以及营养等方面发挥重要作用。益生菌代谢产生多种消化酶，能够促进营养物质吸收，尤其是蛋白质和氨基酸类物质的消化吸收，有利于畜禽体内蛋白质的合成和沉积。研究表明，饲粮添加地衣芽孢杆菌[17]、枯草芽孢杆菌[18]、丁酸梭菌[19]等益生菌均能够显著提高肉鸡血清总蛋白含量。本试验结果显示，饲粮添加由丁酸梭菌和屎肠球菌组成的复合微生态制剂能够显著提高蛋鸡血清总蛋白和球蛋白含量，与上述研究结果相似。甘油三酯的主要功能是储能和保护内脏，胆固醇是细胞膜的重要组成，也是合成各种激素、胆酸的前体物质，是细胞基本生命活动不可缺少的重要物质。王仁华[20]研究表明，肉鸡饲粮中添加2%酿酒酵母，能够显著降低血清中甘油三酯和胆固醇含量。本试验结果显示，饲粮添加复合微生态制剂对蛋鸡血清中总胆固醇、甘油三酯含量无明显影响，与上述研究存在差异，可能是由于试验动物、益生菌种类和试验条件的不同。尿酸是嘌呤氧化后生成的产物，尿酸产生过多或尿酸排泄异常导致的血液中尿酸过高，是痛风的主要病因。长期高血尿酸会引起关节炎、尿酸性肾病等疾病。王佰魁等[21]研究发现，饲粮中添加0.1%的枯草芽孢杆菌制剂，肉鸡血清中尿酸含量显著降低。Hatab等[22]研究发现，饲粮中添加一定水平的由枯草芽孢杆菌和屎肠球菌组成的复合微生态制剂，显著降低了蛋鸡血清尿酸含量。本试验结果显示，饲粮中添加由丁酸梭菌和屎肠球菌组成的复合微生态制剂能够显著降低蛋鸡血清中尿酸含量，与上述研究结果相符。3.4复合微生态制剂对蛋鸡肠道形态的影响动物机体对营养物质的消化吸收主要通过小肠来完成。绒毛的高度、绒毛之间隐窝的深度以及绒毛的高度与隐窝的深度的比值（V/C），是评定肠的消化吸收能力的重要指标。肠绒毛越长，表明成熟的上皮细胞越多，对养分吸收能力也就越强；肠隐窝的深浅可说明肠上皮细胞的生成率，隐窝越浅表明上皮细胞发育越成熟，相应的分泌能力越强；V/C能够综合反映肠道的功能和结构发育，V/C值越高表明肠黏膜结构越完善，肠道消化吸收能力也就越强[23]。Lee等[24]研究表明，肉鸡饲粮中添加一定水平的枯草芽孢杆菌，能够提高小肠的绒毛高度。蛋鸡饲粮中添加丁酸梭菌，能够显著提高海兰褐蛋用仔公鸡小肠各段的绒毛高度、V/C值[25]。张金金等[8]研究也表明，饲粮中添加2.5×108 CFU/kg的丁酸梭菌，能够显著提高蛋鸡小肠各肠段的绒毛高度以及回肠的V/C值，并且对十二指肠和回肠的肠壁厚度也有改善作用。在饲粮中添加2.0×106 CFU/g的屎肠球菌能够显著提高42日龄肉公鸡回肠绒毛高度、空肠V/C值[26]。本试验结果显示，饲粮添加由丁酸梭菌和屎肠球菌组成的复合微生态制剂能够显著提高空肠、回肠和盲肠的绒毛高度及V/C值，与上述研究结果相似。复合微生态制剂对蛋鸡肠道形态的改善，一方面是因为丁酸梭菌代谢产生的丁酸，是结肠黏膜细胞生长的主要能源物质，也是修复肠上皮细胞和细胞再生所需的主要营养物质，对维持肠上皮的正常结构以及促进肠道细胞的增殖和分化具有重要作用[4]；另一方面，也可能是由于屎肠球菌具有很强的黏附作用，能够紧密附着在肠道表面，形成生物屏障，从而保护肠道结构[27]，具体的作用机制尚待研究。4结论本试验条件下，饲粮添加100 g/t由丁酸梭菌和屎肠球菌组成的复合微生态制剂显著提高了产蛋高峰期蛋鸡的产蛋性能、蛋品质，改善了蛋鸡血清生化指标和肠道绒毛结构。