锦鲫的养殖方式逐步向规模化、集约化发展。但长期使用或过量使用抗生素类药物造成药物在鱼体和环境中的残留，导致水体环境恶化。化学类药物中含有大量的有毒有害物质造成水产动物生产性能下降[1-2]。中药具有毒副作用小、无耐药性、不易产生药物残留、作用广泛[3]等优势，作为添加剂包被饵料广泛应用于水产养殖中。中药中含有多种免疫活性物质，可提高动物食欲，增强免疫力、抗病力，提高成活率[4-8]。在预防和治疗鱼类疾病中，单一的、不同的中药联用可将中药的药效发挥最大。黄芪中含量最高、最有效的活性物质为黄芪多糖，在提高动物机体免疫力、抗病毒、抗菌等方面均具有较好的效果[9-10]。地榆具有抗炎、抑菌等作用[11]。没食子酸是五倍子主要活性成分之一，通过有效凝固微生物体内的原生质及多种酶发挥作用，可有效清除自由基，抗菌、抗病毒。本试验探讨中药水煎液单用及联用对鲫鱼的免疫保护作用，为鱼类疾病的防治提供参考。1材料与方法1.1主要试剂试验菌株为嗜水气单胞菌（TPS），由吉林农业大学预防兽医实验室保存分离；中药提取物购自长春中医药大学附属医院。总RNA提取试剂盒购自BioFLux公司；反转录试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司；鲫鱼酸性磷酸酶（ACP）、碱性磷酸酶（AKP）、超氧化物歧化酶（SOD）、溶菌酶（LZM）、血清球蛋白M（IgM）和补体C3、C4 ELISA试剂盒均购自奥丁生物科技生物公司。1.2饵料制备黄芪、地榆、五倍子、联用浓度（黄芪∶地榆∶五倍子=1∶1∶1）分别为2.500、2.500、1.250、0.625 g/mL，均为三味单味中药水煎液及联用中药水煎液的最小抑菌浓度，混入饵料以1∶1比例混匀，65 ℃烘干保存。饵料购自山东淄博通威饲料有限公司。1.3试验设计将200尾健康鲫鱼分为5组（对照组、黄芪组、地榆组、五倍子组、联用组），每组40尾，置于75 L水箱中养殖。试验期50 d。每日定时投喂1次，投喂量为鲫体重的3%~4%，首次免疫连续投喂7 d，空腹间隔2 d后继续免疫，免疫方式与首次免疫一致。1.4样品收集在免疫前0 d和免疫后第34 d，每组中随机选择3尾鲫鱼采用MS-222麻醉，取组织（肝、脾、肾、鳃、肠）和血液。血液4 ℃、4 500 r/min离心15 min，取血清，－80 ℃保存血清和组织。1.5测定指标及方法1.5.1血清指标参照奥丁生物科技公司ELISA试剂盒说明书进行操作测定血清ACP、AKP、SOD、LZM、IgM和补体C3、C4等指标，采用全波长酶标仪于反应终止后的15 min内测定450 nm处的吸光度值（OD450 nm）。以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制出标准曲线，以样品的OD值计算出样品的实际浓度。1.5.2实时荧光定量PCR组织块于液氮中研磨，根据BioFlux试剂盒的操作说明提取细菌的总RNA，采用全式金反转录试剂盒将RNA反转录cDNA，以各组织中提取的cDNA作为模板，进行qRT-PCR检测各组织中NF-KB、MYD88、IL-1β、TNF-α和IFN-γ表达水平，引物序列见表1。对照组设置无cDNA模板，采用免疫前（0 d）的各组织作为参照，每个样品3个重复，以β-tin作为内参基因，反应体系见表2。反应条件为：95 ℃ 30s，95 ℃ 5 s，59 ℃ 37 s，40个循环。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.02.012.T001表1荧光定量PCR所用引物基因引物序列（5'→3'）TNF-αTTATGTCGTGCGGCCTTCAGGTCTTTCCGTTGTCGCTTTIFN-γAAGTCGGGTGTCGCAAGTCAGCAAATTCCCCAGIL-1βATGATGCCGAATGGAACCTTCTCCCAGTCGTCAAAMYD88GCCGTCGCAAGTTGTTGCTTTTTCCTCGCTCATGTNF-KBAATGTGGTGCGTCTGTGCTTTGTTGTCATAGATGGGGTTGGAβ-tingAATGTGGTGCGTCTGTGCTTTGTTGTCATAGATGGGGTTGGA10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.02.012.T002表2qRT-PCR反应体系项目体积/μL合计20.02×perfect start Green qpcr super Mix(+DyeⅠ/+DyeⅡ)10.0上游引物0.5下游引物0.5cDNA1.0Nuclease-free water8.01.5.3攻毒保护性试验鲫鱼在连续饲喂含有中药包被的鱼粮34 d后，禁食2 d。对鲫鱼进行攻毒，测定免疫保护率。活化嗜水气单胞菌（TPS）（1×106 CFU/mL），将菌液浓度调整为1×107 CFU/mL。每个试验组选取20尾鲫鱼，腹腔注射200 μL菌液，连续观察14 d，记录死亡情况。1.6数据统计与分析数据采用SPSS 22软件进行差异显著性分析，采用Graph Prism 7绘制所需图形。P0.05表示差异显著，P0.01表示差异极显著。2结果与分析2.13种中药单用及联用对鲫鱼血清免疫指标的影响（见表3）由表3可知，免疫34 d，联用组鲫鱼血清的IgM含量显著高于其余4组（P0.05），五倍子组、地榆组显著高于黄芪组、对照组（P0.05）。与对照组相比，联用组鲫鱼血清的C3活性极显著升高（P0.01），地榆组和黄芪组的C3活性显著升高（P0.05）。与对照组相比，联用组鲫鱼血清的LZM活性显著升高（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.02.012.T003表33种中药单用及联用对鲫鱼血清免疫指标的影响组别IgMC3C4LZM对照组2.27±0.23c187.29±2.72Bc107.89±2.8910.17±0.23b黄芪组2.95±0.05c230.05±1.05ABab111.87±1.089.44±0.56b五倍子组3.95±0.05b202.64±2.64ABbc119.83±0.178.93±0.07b地榆组3.85±0.15b248.14±2.14ABa124.73±1.779.98±0.02b联用组4.99±0.01a264.14±1.14Aa108.59±2.0813.93±0.07a注：同列数据肩标不同小写字母表示差异显著（P0.05），不同大写字母表示差异极显著（P0.01），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。mg/L2.23种中药单用及联用对鲫鱼血清抗氧化指标的影响（见表4）由表4可知，免疫34 d，与对照组相比，地榆组和五倍子组鲫鱼血清的CAT活性显著升高（P0.05），联用组的CAT活性极显著升高（P0.01）；联用组、地榆组和五倍子组鲫鱼血清的SOD活性显著升高（P0.05），黄芪组的SOD活性极显著升高（P0.01）；与对照组相比，地榆组的GSH-Px活性显著升高（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.02.012.T004表43种中药单用及联用对鲫鱼血清抗氧化指标的影响组别CAT/(ng/L)SOD/(pg/L)GSH-Px/(nmol/L)对照组68.52±0.48Bc15.95±0.67Bd29.54±0.54b黄芪组69.19±0.81Bbc35.81±0.81Aa30.35±1.27b五倍子组83.24±1.76ABb24.64±0.64ABc27.03±1.89b地榆组98.08±1.96ABa29.41±1.42ABbc36.48±1.48a联用组109.21±0.79Aa29.77±0.23ABb27.06±2.03b2.33种中药单用及联用对鲫鱼不同组织中细胞因子含量的影响2.3.13种中药单用及联用对鲫鱼肝脏中细胞因子含量的影响（见表5）由表5可知，免疫34 d，与对照组相比，联用组鲫鱼肝脏的IL-1β、TNF-α含量极显著升高（P0.01），地榆组鲫鱼肝脏的IL-1β含量显著升高（P0.05），五倍子组、地榆组、黄芪组鲫鱼肝脏的TNF-α含量显著升高（P0.05）。与对照组相比，各试验组鲫鱼肝脏的IFN-γ、NF-KB、MYD88含量均显著升高（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.02.012.T005表53种中药单用及联用对鲫鱼肝脏中细胞因子含量的影响组别IL-1βTNF-αIFN-γNF-KBMYD88对照组1.00±0.02Bb3.02±0.04Bb20.02±0.02b20.03±0.05d3.5±0.12c黄芪组2.95±0.05ABb10.01±0.22ABa66.77±0.53a59.89±0.31b6.69±0.06b五倍子组2.15±0.15ABb10.29±0.15ABa79.76±0.29a75.25±0.36a8.68±0.18a地榆组5.01±0.03ABa9.31±0.38ABa60.99±0.52a69.91±0.46ab6.96±0.17b联用组6.95±0.05Aa12.51±0.02Aa75.25±4.25a69.81±0.64ab8.85±0.08ang/L2.3.23种中药单用及联用对鲫鱼肾脏中细胞因子含量的影响（见表6）由表6可知，免疫34 d，与对照组和地榆组相比，联用组鲫鱼肾脏IL-1β含量极显著升高（P0.01），五倍子组和黄芪组IL-1β含量显著升高（P0.05）。与对照组相比，联用组TNF-α含量极显著升高（P0.01），五倍子组、地榆组、黄芪组TNF-α含量显著升高（P0.05）；联用组IFN-γ含量极显著升高（P0.01），五倍子组、地榆组、黄芪组IFN-γ含量显著升高（P0.05）；联用组、五倍子组NF-KB含量极显著升高（P0.01）；联用组、五倍子组MYD88含量极显著升高（P0.01），黄芪组和地榆组的MYD88含量显著升高（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.02.012.T006表63种中药单用及联用对鲫鱼肾脏中细胞因子含量的影响组别IL-1βTNF-αIFN-γNF-KBMYD88对照组1.02±0.01Bc3.01±0.01Bd0.21±0.01Bc3.02±0.03Bb0.51±0.01Bc黄芪组2.95±0.05ABb10.18±0.38ABbc0.91±0.06ABb3.81±0.14ABb2.34±0.15ABb五倍子组3.23±0.03ABb8.79±0.29ABc0.87±0.03ABb11.59±0.18Aa4.78±0.11Aa地榆组1.43±0.06Bc12.83±0.42ABab0.91±0.07ABb10.08±0.21ABab2.03±0.13ABb联用组6.95±0.05Aa14.24±0.31Aa1.75±0.05Aa11.97±0.03Aa5.03±0.16Aang/L2.3.33种中药单用及联用对鲫鱼脾中细胞因子含量的影响（见表7）由表7可知，免疫34 d，与对照组相比，黄芪组、联用组鲫鱼脾中的IL-1β含量显著升高（P0.05）；五倍子组的TNF-α含量极显著升高（P0.01），黄芪组、联用组、地榆组的TNF-α含量显著升高（P0.05）；各试验组的IFN-γ含量均显著升高（P0.05）；五倍子组的NF-KB含量显著升高（P0.05），地榆组NF-KB含量显著下降（P0.05）；五倍子组、地榆组、联用组的MYD88含量显著升高（P0.05）。地榆组的NF-KB含量极显著低于五倍子组（P0.01）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.02.012.T007表73种中药单用及联用对鲫鱼脾脏中细胞因子含量的影响组别IL-1βTNF-αIFN-γNF-KBMYD88对照组0.11±0.01b5.02±0.02Bd1.03±0.02c0.31±0.01ABb20.02±0.01c黄芪组0.58±0.01a13.62±0.31ABb3.28±0.12ab0.28±0.01ABb26.55±2.86c五倍子组0.23±0.01b16.28±0.29Aa3.02±0.10b0.55±0.05Aa55.42±1.98a地榆组0.15±0.03b10.81±0.34ABc2.89±0.11b0.12±0.01Bc43.15±2.85b联用组0.50±0.01a13.26±0.31ABb4.05±0.07a0.28±0.01ABb60.51±0.56ang/L2.3.43种中药单用及联用对鲫鱼肠道中细胞因子含量的影响（见表8）由表8可知，免疫34 d，与对照组相比，黄芪组、联用组鲫鱼肠道中的IL-1β含量极显著升高（P0.01），地榆组、五倍子组的IL-1β含量显著升高（P0.05）；各试验组的TNF-α、MYD88含量显著升高（P0.05）；地榆组、联用组的IFN-γ含量极显著升高（P0.01），五倍子组、黄芪组的IFN-γ含量显著升高（P0.05）；联用组的NF-KB含量极显著升高（P0.01），黄芪组的NF-KB含量显著升高（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.02.012.T008表8三种中药水煎液单用及联用对肠中细胞因子含量的影响组别IL-1βTNF-αIFN-γNF-KBMYD88对照组1.02±0.01Bc0.22±0.02b3.02±0.01Bc1.02±0.03Bc25.12±0.12b黄芪组10.45±0.06Aa0.79±0.01a8.92±0.44ABb2.97±0.06ABb59.61±0.71a五倍子组4.30±0.10ABb0.75±0.02a11.56±0.62ABb2.05±0.08ABbc63.42±0.51a地榆组8.45±0.09ABa0.70±0.01a20.16±0.55Aa2.01±0.19ABbc69.93±0.66a联用组10.44±0.07Aa0.84±0.02a17.11±0.19Aa5.01±0.06Aa69.28±0.82ang/L2.3.53种中药单用及联用对鲫鱼腮中细胞因子含量的影响（见表9）由表9可知，免疫34 d，与对照组相比，黄芪组、联用组鲫鱼腮中的IL-1β含量显著升高（P0.05）；黄芪组、联用组、地榆组的TNF-α含量极显著升高（P0.01），五倍子组的TNF-α含量显著升高（P0.05）；五倍子组、联用组的IFN-γ含量显著升高（P0.05）；五倍子组、地榆组、联用组的NF-KB含量显著升高（P0.05）；与对照组、黄芪组、联用组相比，五倍子组和地榆的MYD88含量显著升高（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.02.012.T009表93种中药液单用及联用对鲫鱼腮中细胞因子含量的影响组别IL-1βTNF-αIFN-γNF-KBMYD88对照组0.21±0.01b15.02±0.01Bc0.33±0.04b40.12±0.25c0.51±0.06b黄芪组0.52±0.01a63.09±0.85Aa0.50±0.01b45.78±0.35c0.55±0.03b五倍子组0.40±0.01b52.03±0.91ABb0.65±0.01a87.78±0.34a0.87±0.05a地榆组0.37±0.02b60.27±0.41Aa0.47±0.02b90.74±0.39a0.71±0.04a联用组0.51±0.01a63.03±0.59Aa0.74±0.01a54.24±0.12b0.52±0.46bng/L2.4攻毒后鲫鱼免疫保护率（见表10）由表10可知，对照组在攻毒后7 d内全部死亡，黄芪组在攻毒后10 d内全部死亡；经过14 d的观察，地榆组、五倍子组、联用组在的免疫保护率高于对照组和黄芪组。其中地榆组的免疫保护率为20%，五倍子组为25%，联用组为40%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.02.012.T010表10攻毒后鲫鱼免疫保护率组别死亡数量/尾免疫保护率/%1 d2 d3 d4 d5 d6 d7 d8 d9 d10 d11 d12 d13 d14 d对照组344512100000000黄芪组232432211000000地榆组3124211100000025五倍子组2214212110000020联用组23121210000000403讨论中药具有促进生长、提高生产力和免疫力的良好综合效果，无耐药性、低残留。研究表明，中药具有显著的抑菌效果[12-13]和多种活性物质，可有效改善动物的免疫功能，能够增加抗体和补体水平诱导多种细胞因子提高机体的免疫力，增强动物对病原菌的抵抗力[14]。3.13种中药单用及联用对鲫鱼血清免疫指标的影响免疫球蛋白在动物的特异性免疫中发挥重要作用。鱼类的免疫球蛋白可通过可溶性抗体的形式分泌至血液或者其他体液中调控体液免疫[15]。研究发现，连续饲喂中药添加剂可提高鲫鱼血清总蛋白和白蛋白含量[16]。本试验结果发现，与对照组相比，饲喂联用中药的鲫鱼IgM含量更高，而其他单味中药试验组中IgM含量与对照组相比差异不显著，说明联用中药能够显著提高鲫鱼中IgM含量。免疫后的鲫鱼血清中的补体C3、C4含量也存在不同的上升趋势，其中黄芪组和联用中药组显著高于对照组。王凡等[17]采用复方中草药探究虹鳟非特异性免疫功能，发现添加0.6%的黄芪组的虹鳟血清中补体C3、C4含量显著升高。3.23种中药单用及联用对鲫鱼血清抗氧化指标的影响鱼类具有相对完整的免疫系统，其免疫反应机制与哺乳动物相似[18]。李俊世等[19]研究发现，第12 d黄芪与复方五倍子组草鱼血清中LZM酶活性最强。王凡等[17]采用复方中草药探究虹鳟非特异性免疫功能，发现等比添加黄芪的复方制剂可使虹鳟血清SOD酶活力极显著升高。袁林聪等[20]研究发现，饵料中添加黄芪、地榆、五倍子等多种中药联用可显著提高江鲤血清中SOD、CAT、GSH-Px的活性，与本试验结果一致，均表现为联用中药组鲫鱼血清中各项指标高于单味中药组。3.33种中药单用及联用对鲫鱼各组织中细胞因子含量的影响细胞因子具有调节先天免疫、适应性免疫以及血细胞生成、细胞生长、修复受损组织等作用[21-23]。本试验对脏器中各细胞因子IFN-γ、IL-1β、MYD88、NF-KB、TNF-α的转录水平进行qRT-PCR检测。免疫组中各组织TNF-α、IL-1β、IFN-γ、MYD88、NF-KB的水平均有所提升，其中肠道、脾、肝脏的表达量极为显著。中药在进入机体后最先接触的是肠道，肠道中细胞因子的转录水平最先表达且表达量最高。研究表明，黄芪中的多糖和皂苷能够提高机体免疫功能，借助细胞免疫和体液免疫提高机体的免疫活性[24]。地榆中活性成分皂苷，具有体外免疫调节作用，并且对细胞因子具有促进作用，提高机体的免疫功能[25]。五倍子中的鞣质可抵抗DPPH自由基、H2O2和NO羟自由基，清除脂质过氧化产生的自由基，上述功能可能成为五倍子提高机体免疫力的关键因素。没食子酸可以维持细胞膜流动，减少自由基对肠道的损害，提高肠道免疫功能等。郭海燕等[26]研究发现，没食子酸可以促进淋巴细胞增殖和巨噬细胞吞噬作用。4结论本试验中，中药能够促进鲫鱼的生长，诱导鲫鱼体液免疫并分泌各种免疫相关酶以及IgM，提高各组织细胞因子的转录水平，加强鲫鱼对细菌入侵的抵抗力，具有一定的免疫保护作用。