黄花蒿（Artemisia annua L.）又名青蒿、臭蒿、草蒿，是双子叶植物纲、菊科、蒿属一年生草本菊科植物，遍布于中国全境，目前已在世界各地引种[1]。黄花蒿作为一种传统中药，具有清热解毒、凉血、健胃等功效，黄花蒿中含有的青蒿素是抗疟活性的主要成分[2]。黄花蒿还含有黄酮、多糖、多酚、挥发油等多种生物活性成分，并表现出广泛的药理特性，包括抗炎、抗菌和抗微生物等[3]。多糖是由许多单糖分子通过糖苷键结合而成的天然大分子化合物，广泛存在于植物、动物和微生物中，具有提高抗氧化酶活性、抑制脂质过氧化、清除自由基、保护生物膜和抗衰老等作用[4-5]。养殖过程中，各种各样的问题均可能致使动物发生氧化应激，进而导致氧化损伤。消除氧化损伤最有效的方法是使用抗氧化剂，但目前合成的抗氧化剂可能存在一定的毒副作用[6]。因此，开发天然、无毒副作用的抗氧化剂是当前备受关注的热点问题。本试验旨在研究不同采收时期黄花蒿多糖的体外抗氧化活性变化规律，为科学开发利用黄花蒿多糖提供参考。1材料与方法1.1样品与试剂黄花蒿于2021年5月—7月采自呼和浩特市境内。木瓜蛋白酶、纤维素酶以及果胶酶（酶活力分别为500 U/mg）购自上海源叶生物科技有限公司；维生素C（VC）、过氧化氢购自Sigma-Aidarch公司；1,1－二苯基－2－三硝基苯肼（DPPH）购自Phygene公司；无水乙醇、水杨酸、K3[Fe(CN)6]、C2HCl3O2、FeCl3、FeSO4、NaH2PO4、Na2HPO4等均为分析纯。1.2测定指标及方法1.2.1黄花蒿多糖的制备每期采集的黄花蒿晾干粉碎，各准确称取40.0 g，按1∶15料液比（g/mL）加入蒸馏水600 mL（每期3个重复），按1∶1∶1的比例加入纤维素酶、木瓜蛋白酶、果胶酶各6 g，150 r/min 50 ℃振荡3 h进行酶解，75 ℃水浴1 h，抽滤浓缩、无水乙醇沉淀、冷冻等，制得黄花蒿多糖粉末。1.2.2黄花蒿多糖含量的测定0.1 g/L的葡萄糖标准溶液配制步骤参照郭燕菲等[7]方法，绘制葡萄糖标准曲线，得出其标准曲线方程，代入计算样品中多糖的含量。1.3抗氧化活性的测定1.3.1DPPH·清除率测定确配制浓度为0.5、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 g/L的多糖样品溶液，DPPH·自由基清除率参照张立娟等[8]的方法稍做修改，517 nm处测定吸光度。每组测定3个平行；VC溶液为阳性对照。1.3.2羟基自由基（OH·）清除率测定准确配制浓度为0.5、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 g/L的多糖样品溶液，OH·的清除率参照韩丹[9]的方法稍做修改，517 nm处测定吸光度。每组测定3个平行；VC溶液为阳性对照。1.3.3超氧阴离子（·O2-）清除率测定准确配制浓度为0.5、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 g/L的多糖样品溶液，·O2-自由基清除率参照欧燕香等[10]的方法稍做修改，325 nm处测定吸光度值A2。每组测定3个平行；VC溶液为阳性对照。1.3.4总抗氧化能力的测定（ABTS法）参照试剂盒说明书进行测定，测定405 nm处的吸光度值，绘制标准曲线，计算总抗氧化能力A405 nm。1.3.5总还原能力的测定准确配制浓度为0.5、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 g/L的多糖样品溶液，总还原能力参照孙涛涛[11]的方法稍做修改，700 nm处测定吸光度值A700 nm。每组测定3个平行，VC溶液为阳性对照。1.4数据统计与分析数据采用Micosoft Excel 2010整理，利用SAS 9.2软件对不同采收月份的数据进行单因素方差分析，采用Duncan's法进行多重比较；利用回归分析程序对多糖添加浓度与相应指标间的回归效应进行统计分析。P0.01表示组间差异或回归关系差异极显著，P0.05表示组间差异或回归关系差异显著。2结果与分析2.1不同采收时期黄花蒿多糖的含量葡萄糖溶液标准浓度曲线见图1。由图1可知，葡萄糖标准曲线回归方程为y=13.824x+0.032 7，R2=0.999 6。不同采收时期黄花蒿多糖的含量范围分布为39%~44%，高低顺序依次为7月、6月、5月，黄花蒿多糖含量分别为43.35%、41.09%、39.81%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.014.F001图1葡萄糖溶液标准浓度曲线2.2不同采收时期黄花蒿多糖体外抗氧化活性的评价2.2.1不同采收时期黄花蒿多糖对DPPH·的清除能力（见表1）由表1可知，不同月份采收的黄花蒿多糖对DPPH·的清除能力均随多糖浓度增加呈极显著的一次线性或二次曲线升高（P0.01）。多糖浓度为0.5~2.0 g/L时，5月份采收的黄花蒿多糖对DPPH·的清除率均极显著高于其他两个月（P0.01）。多糖浓度为4.0~6.0 g/L时，5月与7月采收的黄花蒿多糖对DPPH·的清除率均极显著高于6月（P0.01）。多糖浓度为8.0~10.0 g/L时，3个月份黄花蒿多糖对DPPH·的清除率差异不显著（P0.05）。在整个浓度区间内，各个月份黄花蒿多糖对DPPH·的清除率极显著低于相同浓度范围内的VC组（P0.01）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.014.T001表1不同采收时期黄花蒿多糖对DPPH·的清除率项目黄花蒿多糖浓度/(g/L)P值0.52.04.06.08.010.0一次二次VC94.07±0.59A94.13±0.49A94.37±0.50A94.01±0.29A94.07±0.39A94.13±0.51A0.8270.888黄花蒿多糖（5月采收）75.44±0.09B75.77±0.60B79.79±1.43B81.97±0.92B83.45±1.70B84.87±2.31B0.0010.001黄花蒿多糖（6月采收）72.84±0.89C74.56±0.43C76.51±0.54C77.88±3.36C84.10±2.92B82.38±3.01B0.0010.001黄花蒿多糖（7月采收）72.72±0.31C74.96±0.64C80.01±0.57B81.66±1.95B82.77±3.72B85.07±4.79B0.0010.001注：同列数据肩标不同大写字母表示差异极显著（P0.01），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；同行数据进行回归分析，P0.01表示回归关系差异极显著，P0.05表示回归关系差异不显著；下表同。%2.2.2不同采收时期黄花蒿多糖对OH·的清除能力（见表2）由表2可知，不同月份采收的黄花蒿多糖对OH·的清除能力均随多糖浓度增加呈极显著的一次线性或二次曲线升高（P0.01）。多糖浓度为0.5~8.0 g/L时，7月采收的黄花蒿多糖对OH·基的清除能力极显著高于其他两个月（P0.01）。当多糖浓度达到10.0 g/L时，3个月份采收的黄花蒿多糖对OH·的清除率差异不显著（P0.05），其对OH·的清除率分别为94.57%（5月）、96.08%（6月）、95.03%（7月），表明黄花蒿多糖对OH·具有很好的清除能力。在整个浓度区间，各月份黄花蒿多糖对OH·的清除率极显著低于相同浓度的VC组（P0.01）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.014.T002表2不同采收时期黄花蒿多糖对OH·的清除率组别黄花蒿多糖浓度/(g/L)P值0.52.04.06.08.010.0一次二次VC99.70±0.20A99.82±0.20A99.67±0.19A99.84±0.09A99.64±0.18A99.78±0.15A0.9990.999黄花蒿多糖（5月采收）9.70±2.67C45.57±2.14D51.31±1.73D70.88±1.32D83.40±1.06D94.57±2.96B0.0010.001黄花蒿多糖（6月采收）12.19±3.31C50.84±5.02C56.88±4.55C76.41±1.83C85.74±0.39C96.08±1.55B0.0010.001黄花蒿多糖（7月采收）18.61±2.96B65.84±4.53B67.14±1.92B81.45±0.98B89.41±1.08B95.03±2.77B0.0010.001%2.2.3不同采收时期黄花蒿多糖对·O2-的清除能力（见表3）由表3可知，不同月份采收的黄花蒿多糖对·O2-的清除能力都随多糖浓度的增加呈极显著的一次线性或二次曲线升高（P0.01）。多糖浓度在0.5~6.0 g/L范围内时，7月采收的黄花蒿多糖对·O2-的清除能力极显著高于其他两个月（P0.01）。多糖浓度在8.0~10.0 g/L范围内时，7月采收的黄花蒿多糖对·O2-的清除率极显著高于6月（P0.01）；5月和6月花蒿多糖对·O2-的清除率之间差异不显著（P0.05）。在整个浓度区间内，各个月份的黄花蒿多糖对·O2-的清除率极显著低于相同浓度的VC组（P0.01）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.014.T003表3不同采收时期黄花蒿多糖对·O2-的清除率项目黄花蒿多糖浓度/(g/L)P值0.52.04.06.08.010.0一次二次VC82.73±3.67A98.12±0.62A98.49±0.45A98.55±0.33A98.70±0.53A98.85±0.57A0.0010.001黄花蒿多糖（5月采收）20.91±0.91C58.24±0.24D82.06±0.54D90.49±0.23D93.76±0.28BC94.79±0.35BC0.0010.001黄花蒿多糖（6月采收）22.18±1.23C59.21±1.37C83.82±0.24C91.58±0.34C93.09±1.14C94.36±0.51C0.0010.001黄花蒿多糖（7月采收）26.25±1.68B68.69±0.45B89.05±1.14B94.29±0.19B94.46±0.65B95.00±0.48B0.0010.001%2.2.4不同采收时期黄花蒿多糖的总抗氧化能力（见表4）由表4可知，不同月份采收的黄花蒿多糖其抗氧化能力都随多糖浓度的增加呈极显著的一次线性或二次曲线升高（P0.01）。多糖浓度为0.5 g/L时，不同月份采收的黄花蒿多糖的抗氧化能力差异不显著（P0.05）。浓度为2.0 g/L时，7月采收的黄花蒿多糖的抗氧化能力极显著高于其他两个月（P0.01）。浓度为4.0 g/L时，5月与7月采收的黄花蒿多糖的抗氧化能力极显著高于6月（P0.01）。浓度达到6.0~10.0 g/L时，不同月份采收的黄花蒿多糖的抗氧化能力均趋于平缓，差异不显著（P0.05），即ABTS+·的清除能力趋于平缓。在整个浓度区间内，各个月份采收的黄花蒿多糖的总抗氧化能力均极显著低于相同浓度的VC组（P0.01）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.014.T004表4不同采收时期黄花蒿多糖的总抗氧化能力组别黄花蒿多糖浓度/(g/L)P值0.52.04.06.08.010.0一次二次VC1.47±0.00A1.47±0.00A1.48±0.00A1.47±0.00A1.48±0.00A1.49±0.00A0.0010.001黄花蒿多糖（5月采收）0.54±0.00B0.94±0.01C1.39±0.03B1.39±0.02B1.38±0.02B1.38±0.01B0.0010.001黄花蒿多糖（6月采收）0.52±0.02B0.89±0.01D1.33±0.02C1.38±0.00B1.39±0.00B1.37±0.01B0.0010.001黄花蒿多糖（7月采收）0.54±0.02B0.98±0.01B1.39±0.01B1.40±0.01B1.39±0.01B1.39±0.02B0.0010.001mmol/L2.2.5不同采收时期黄花蒿多糖的总还原能力（见表5）由表5可知，不同月份采收的黄花蒿多糖的总还原能力均随浓度的增加呈一次线性或二次曲线升高（P0.01）。多糖浓度为0.5 g/L时，6、7月采收的黄花蒿多糖的总还原能力极显著高于5月（P0.01），极显著低于相同浓度的VC组（P0.01）。浓度为2.0~10.0 g/L时，6月采收的黄花蒿多糖还原能力极显著高于其他两个月（P0.01），7月份采收的黄花蒿多糖还原能力极显著高于5月份（P0.01）。当浓度为6.0~10.0 g/L时，6月、7月采收的黄花蒿多糖的还原能力均极显著高于相同浓度的VC组（P0.01），说明黄花蒿多糖具有良好的总还原能力。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.03.014.T005表5不同采收时期黄花蒿多糖的总还原能力项目黄花蒿多糖浓度/(g/L)P值0.52.04.06.08.010.0一次二次VC2.28±0.04A2.39±0.01A2.40±0.04A2.31±0.02C2.28±0.04C2.24±0.03D0.0010.001黄花蒿多糖（5月采收）0.30±0.00C0.89±0.02D1.55±0.02D2.16±0.02D2.22±0.03C2.30±0.04C0.0010.001黄花蒿多糖（6月采收）0.35±0.01B1.22±0.03B2.31±0.02B2.48±0.01A2.55±0.06A2.54±0.05A0.0010.001黄花蒿多糖（7月采收）0.33±0.00B1.02±0.02C1.99±0.04C2.33±0.01B2.39±0.01B2.40±0.02B0.0010.0013讨论自由基是一种非常活跃且不稳定的原子群，以不断夺取其他电子并引起氧化反应保持稳定[12]。正常的生物氧化及其产生的自由基对机体是有益的，可以调节细胞间的信号传递，防止病毒和细菌入侵机体，防止感染等[13]。由于机体自身的活动以及各种外部因素的干扰和侵害等，使自由基很难保持平衡，过量的活性氧（ROS）或活性氮（RNS）诱导的氧化应激会对细胞结构和生物分子功能造成重大损害，进而影响动物的生产性能，甚至导致疾病发生[14]。近年来，从天然植物中提取的多糖及其衍生物在体内和体外抗氧化活性方面引起了广泛关注。特别是在体外抗氧化方面，多糖被认为是有效的自由基清除剂、还原剂以及铁螯合剂等。DPPH·清除活性被广泛用于评价植物提取物的体外抗氧化活性，该方法基于抗氧化剂提供的氢原子将DPPH·转化为非自由基的DPPH形式，DPPH乙醇溶液呈紫色，在517 nm处有最大吸收峰。当DPPH溶液中加入自由基清除剂时，其乙醇溶液由深紫色变为黄色，变色程度与自由基清除活性呈剂量依赖性，清除率越大其抗氧化能力越强[15-16]。OH·是一类化学性质非常活跃的自由基，也是毒性最大的自由基，过量的OH·会干扰机体正常的新陈代谢，引起DNA、蛋白质、脂类等生物大分子的氧化损伤，破坏正常细胞和组织，加速机体衰老，引发各种疾病[17]。因此，黄花蒿多糖对OH·的清除率越大表明其抗氧化能力越强。超氧阴离子是其他活性氧的前体，通过一系列生理生化反应能够转化为其他氧自由基，导致酶活性降低、细胞膜降解以及细胞凋亡等，对机体危害较大[9]。邻苯三酚在弱碱性条件下自氧化产生·O2-自由基，其自氧化速率与释放·O2-的浓度呈正相关[18]。因此，通过测定抗氧化剂对体系中·O2-的清除作用可以间接评价抗氧化剂的抗氧化能力。ABTS是一种水溶性的自由基引发剂，也是一种显色剂，经活性氧氧化后生成稳定的蓝绿色阳离子自由基ABTS+·。当抗氧化物存在时，ABTS+·的产生会被抑制，在一定波长处检测其吸光值并计算多糖总抗氧化能力，即对ABTS+·的清除能力[19]。还原能力强的物质可以提供更多的电子，不仅能够将Fe3+还原为Fe2+，还可以参与自由基反应形成稳定的物质，测定样品的还原能力可以检测样品是否为良好的电子供体[20]。本试验分析了不同采收时期黄花蒿多糖的含量及其体外抗氧化活性，多糖含量结果表明，7月采收的黄花蒿多糖的含量高于其他两个月，可能是由于7月是黄花蒿植株营养生长最旺盛的时期[21]。体外抗氧化活性结果表明，5月与7月采收的黄花蒿多糖对DPPH·的清除能力高于6月；6月与7月采收的黄花蒿多糖的总还原能力高于5月；7月采收的黄花蒿多糖对OH·、·O2-以及ABTS+·基的清除能力均高于其他两个月；表明黄花蒿多糖具有良好的体外抗氧化活性。万晓莉[22]研究发现，酶解青蒿在体外具有一定的清除ABTS+·和DPPH·的能力，在体内能够提高肉鸡的生长性能以及抗氧化性能，可作为饲料添加剂应用于肉鸡生产，可能是由于其含有多酚、黄酮、多糖以及氨基酸等。施君[23]的研究进一步表明，青蒿多糖能够抑制氧化应激状态下体外免疫细胞中NO的分泌以及ROS和MDA的产生，提高细胞中GSH的水平以及T-SOD的活性，改善细胞的抗氧化作用。植物多糖对自由基具有较强的清除作用，上述研究结果与本试验的结果相一致，表明黄花蒿多糖具有一定的抗氧化作用。4结论5月、6月、7月采收的黄花蒿多糖含量分别为39.81%、41.09%、43.35%，且7月份采收的黄花蒿多糖体外抗氧化活性高于其他两个月份。