合生元（synbiotics）又称合生素，能够刺激益生菌的定殖与生长，提高机体抗病性，改善肠道菌群平衡[1]。姬松茸多糖作为益生元，具有抗肿瘤、抗氧化与增强机体免疫力等多种功效[2]，可以促进乳酸菌生长[3]。姬松茸多糖可以调控动物肠道菌群，抑制多种致病菌，促进乳酸菌的定植[4]。益生菌在保健品和医药领域发挥重要的作用[5]。嗜酸乳杆菌是目前益生菌研究重要的方向[6]。嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）属乳杆菌属，具有调节肠道菌群、增强免疫力与促消化的作用[7-8]，具有一定的耐酸性，但对胃酸的抵抗能力较弱[5,9]，通常采用微胶囊包被使嗜酸乳杆菌顺利到达肠道发挥作用。海藻酸钠是一种常见的微胶囊壁材[10]，但对酸敏感且多孔，无法在胃液环境中对嗜酸乳杆菌起到有效的保护作用[11]。因此，将海藻酸钠与其他多聚物混合包被益生菌是首选解决方案[12]。本试验选用姬松茸多糖与海藻酸钠对嗜酸乳杆菌进行包被，通过海藻酸钠-壳聚糖进行二次包被，检测包埋率、粒径、耐酸性、肠道释放性以及抗菌性等特性评估其性能，旨在制备一种新型合生元微胶囊，为合生元微胶囊的后续应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1主要试剂嗜酸乳杆菌冻干粉，购自山东中科嘉亿生物工程有限公司；姬松茸多糖，由天津农学院动科实验室提纯，含量90%。培养基：MRS培养基、MRS肉汤均购自北京路桥技术股份有限公司；LB培养基、亚硫酸铋培养基、麦康凯培养基均购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司。氯霉素、甘油、无水CaCl2、无菌PBS、猪胆盐、海藻酸钠、壳聚糖、琼脂粉、胃蛋白酶（1∶3 000）、胰蛋白酶（1∶250）均购自北京索莱宝科技有限公司；氯化钠、盐酸，均为分析纯，购自天津市风船化学试剂科技有限公司；氯化钠注射液购自石家庄四药有限公司；氢氧化钠（分析纯）购自天津市索祥化学品有限公司。大肠杆菌O78∶K80（菌株编号CICC10421）、肠炎沙门氏菌（菌株编号CICC21482），由天津农学院动科实验室冻存。1.1.2主要仪器SPH-211B摇床（上海世平实验设备有限公司）、L3660D低速离心机（上海知信实验仪器技术有限公司）、AX224ZH/E电子天平（奥豪斯仪器（上海）有限公司）、TD-C电子天平（天津天马衡基仪器有限公司）、PHB-4便携式pH计（上海仪电科学仪器股份有限公司）、SW-CJ-1FD单人单面超净工作台（江苏通净净化设备有限公司）、LMQ.C立式灭菌器（山东新华医疗器械股份有限公司）、HS-1DN磁力搅拌器（亚速旺（上海）商贸有限公司）、MP-250B恒温培养箱（上海福玛实验设备有限公司）、RVL-100-G正置倒置一体荧光显微镜（艾威仪器科技有限公司）。1.2试验方法1.2.1复合壁材微胶囊的制备1.2.1.1嗜酸乳杆菌的制备溶化冻存的嗜酸乳杆菌，划线接种于MRS琼脂培养基，37 ℃培养36 h，挑取单一菌落接种于100 mL MRS肉汤培养基，摇床180 r/min，37 ℃培养24 h。5 000 r/min离心10 min获得菌泥，PBS洗涤，离心，重悬，终浓度约为7×1010 CFU/mL。1.2.1.2复合壁材对嗜酸乳杆菌的包被经前期正交试验，选用海藻酸钠浓度1.0%、姬松茸多糖浓度1.5%、硬化时间4 min（ASL1组）与海藻酸钠浓度1.5%、姬松茸多糖浓度2.0%、硬化时间12 min（ASL2组）作为试验组。因海藻酸钠浓度过低无法形成微胶囊，选择海藻酸钠浓度1.5%、姬松茸多糖浓度0、硬化时间12 min（SL组）为对照组。采用Cui等[13]方法，取姬松茸多糖配置成水溶液，加入海藻酸钠，共2.5 mL；加入1 mL嗜酸乳杆菌菌液与0.75 mL 15%甘油，采用去离子水0.75 mL补全体系至5 mL。充分搅匀，倒入套筒式注射器，匀速滴入0.2 mol/L CaCl2中，硬化相应时间，采用0.85%生理盐水洗涤。将微胶囊放入0.8%壳聚糖溶液磁力搅拌5 min，放入0.1%海藻酸钠溶液磁力搅拌5 min，0.85%生理盐水洗涤，冻干，得到复合壁材微胶囊。1.2.2包被效果测定1.2.2.1包埋率的计算取0.01 g样品加入1 mL 0.2 mol/L、pH值8的PBS缓冲液，37 ℃培育10 min，摇床37 ℃振荡20 min，彻底从微胶囊中释放嗜酸乳杆菌。采用生理盐水进行梯度稀释至合适浓度，涂布MRS琼脂培养基，37 ℃培养24 h，计数活菌数，每个样品3组重复。包被率=微胶囊中活菌数/初始菌液活菌数×100%(1)式中：微胶囊中活菌数为1 g微胶囊中的含菌量；初始菌液活菌数为1 g菌液的含菌量。1.2.2.2合生元微胶囊形态观察采用光学显微镜观察微胶囊形态结构与直径，测定冻干前后微胶囊直径变化情况。1.2.2.3合生元微胶囊在人工胃、肠液中的效果评估胃液配置：取3.84 mL HCl，加水约800 mL，与10 g胃蛋白酶混匀，加水稀释至1 000 mL。肠液配置：取6.8 g KH2PO4，加500 mL水溶解，采用0.1 mol/L NaOH调节pH值至6.8。取10 g胰酶粉和20 g猪胆盐，适量水溶解，倒入配好的溶液中，稀释至1 000 mL。取0.01 g微胶囊加入含有1 mL胃液的离心管中，摇床37 ℃振荡培养2 h，在5、10、30 min和1、2 h处取样，取胶囊按1.2.2.1计算活菌数，以不含姬松茸多糖的微胶囊（SL）和无包被嗜酸乳杆菌（LA）为对照。取0.01 g微胶囊以纱布包裹，加入含有1 mL肠液的离心管，摇床37 ℃振荡培养4 h，在30 min和1、2、4 h处取样，取纱布中胶囊按1.2.2.1计算活菌数，以不含姬松茸多糖的微胶囊SL为对照。胃液中存活率=经胃液处理后活菌数/微胶囊原有活菌数×100%(2)肠液中存活率=经肠液处理后活菌数/微胶囊原有活菌数×100%(3)1.2.2.4微胶囊在肠液中的释放性能将1.2.2.3肠液中的微胶囊在30 min和1、2、4 h取出，吸取剩余肠液进行平板计数，检测肠液中释放出的活菌数，以SL组微胶囊为对照。1.2.3合生元抑菌效果评估1.2.3.1病原菌的制备超净台内蘸取保存的大肠杆菌O78与肠炎沙门氏菌菌液，LB琼脂培养基上进行平板划线法筛选单一菌落，挑取单一菌落至装有100 mL LB肉汤的锥形瓶，摇床37 ℃、180 r/min培养20 h。将培养好的病原菌悬液采用灭菌过的空白LB肉汤稀释至106 CFU/mL。1.2.3.2抑菌物质的配置挑取嗜酸乳杆菌至100 mL MRS肉汤，37 ℃ 180 r/min振荡培养24 h，稀释至与效果最佳的微胶囊中菌浓度一致。按效果最好组的姬松茸多糖浓度配置溶液，并按比例配置合生元溶液。1.2.3.3牛津杯抑菌试验吸取1.2.3.1中制备的1 mL病原菌液，均匀涂布于LB琼脂培养基，等距放置牛津杯，吸取200 μm嗜酸乳杆菌溶液（LA组）、1.5%（W/V组）姬松茸多糖溶液（AB组）、合生元溶液，以纯水和氯霉素（250 g/L）为对照，去离子水为空白对照组。1.3数据统计与分析试验数据采用WPS软件进行整理，采用SPSS 18.0统计软件进行单因素方差分析，Duncan's法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，以P0.05表示差异显著，P0.01表示差异极显著。2结果与分析2.1合生元微胶囊的包被率、大小及形态（见表1、图1）由表1、图1可知，ASL1组、ASL2组的包被率和活菌数均极显著高于SL组（P0.01）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.02.014.T001表1合生元微胶囊包被率及大小组别包被率/%冻干前胶囊直径/mm冻干后胶囊直径/mm活菌数/(×1010 CFU/g）ASL1组81.78±3.00A1.95±0.10c1.93±0.05a1.22±0.04AASL2组74.00±5.52A2.61±0.03a1.98±0.07a1.11±0.08ASL组2.33±0.36B2.30±0.05b1.74±0.07b0.04±0.01B注：同列数据肩标不同小写字母表示差异显著（P0.05），不同大写字母表示差异极显著（P0.01），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.02.014.F001图1各组冻干微胶囊整体形态（400×）（a） ASL1组冻干微胶囊 （b） ASL2组冻干微胶囊 （c） SL组冻干微胶囊ASL1组冻干前胶囊的平均直径为1.95 mm，冻干后为1.93 mm；ASL2组冻干前胶囊平均直径显著高于ASL1组（P0.05）；ASL2组冻干后胶囊直径缩至1.98 mm。SL组冻干前胶囊平均直径为2.30 mm，冻干后平均直径为1.74 mm，显著低于试验组（P0.05）。2.2不同处理组的嗜酸乳杆菌在模拟胃液中的存活率（见图2、图3）由图2~图3可知，ASL2组的胃液中120 min的存活率为4×10-5%，活菌数远低于106 CFU/g，与LA组和SL组差异不显著（P0.05）；ASL1组的存活率为0.025%，活菌数为4.07×107 CFU/g，与其他组差异极显著（P0.01）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.02.014.F002图2不同处理组的嗜酸乳杆菌在模拟胃液（pH值1.5）中120 min的存活率注：LA（嗜酸乳杆菌）组为对照组，下图同。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.02.014.F003图3不同处理组嗜酸乳杆菌在模拟胃液（pH值1.5）中30~120 min存活率2.3不同处理的嗜酸乳杆菌在模拟肠液中的存活情况（见图4、图5）由图4可知，SL组在模拟肠液（pH值为7.2）中经240 min处理后，嗜酸乳杆菌存活率为0，ASL1组4 h后的存活率为0.44%，ASL2组的存活率为0.23%，两组复合壁材微胶囊的活菌数均可达108 CFU/g。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.02.014.F004图4不同处理的嗜酸乳杆菌在模拟肠液（pH值7.2）中240 min的存活率注：SL组为对照组，下图同。由图5可知，3组微胶囊在模拟肠液中释放最大活菌数均在120 min处。ASL1组在4 h末的活菌数为2.10×106 CFU/g，ASL2组活菌数为1.07×106 CFU/g，SL组活菌数为0.15×106 CFU/g，3者之间差异极显著（P0.01）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.02.014.F005图5不同处理的微胶囊在模拟肠液（pH值为7.2）中240 min内活菌数2.4不同抑菌物质对致病菌的抑菌效果（见表2）由表2可知，LA组、AB组与ASL1组均对大肠杆菌O78∶K80均具有抑菌性，但LA与AB组的抑菌效果显著低于25 g/L的氯霉素（P0.05），ASL1组的抑菌效果与氯霉素差异不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.02.014.T002表2不同抑菌物质对致病菌的抑菌效果组别大肠杆菌O78∶K80肠炎沙门氏菌LA组12.78±1.30b13.69±1.02bAB组11.92±0.42b9.83±1.34cASL1组14.43±1.37ab15.77±0.67ab氯霉素组16.01±1.39a16.16±0.81a空白对照组——注：牛津杯直径8 mm；“—”表示抑菌圈低于8 mm，为不抑菌。mm对于肠炎沙门氏菌，AB抑菌效果显著低于其他组（P0.05）。LA组的抑菌效果显著低于氯霉素（P0.05），但ASL1组的抑菌性与氯霉素差异不显著（P0.05），表明加入AB可以显著的提高LA的抑菌活性。3讨论3.1合生元微胶囊的优势合生元是一种益生菌与益生元结合的复合型微生态制剂[14]。合生元可针对性地促进外源性益生菌的在动物体内的定植与生长，选择性提高内源性益生菌的增殖效力；益生元与益生菌协同作用，可对免疫系统产生调节作用[15]。以微胶囊的形式制作合生元微胶囊，能够解决益生菌难以通过胃酸的问题，还可以使益生元在肠道中对益生菌的后续生物功能产生促进作用。本试验采取冷冻干燥法，与刘丽英等[16]的乳酸菌微胶囊风干法相比，目标菌具有更高的存活率。吕利军[17]研究表明，使用菊粉作为益生元制作合生元胶囊，但菊粉仅在添加量1%时对乳酸菌具有促进作用，且增加益生元浓度对乳酸菌的生长无显著的促进作用，益生元与益生菌之间的关联性较差，而本试验添加姬松茸多糖对嗜酸乳杆菌的生长促进作用已有相关报道[3]。3.2合生元微胶囊的物理特性海藻酸钠是一种常见的微胶囊包被壁材，但其具有多孔的特性且对酸性条件敏感，导致海藻酸钠微胶囊在酸性条件下无法对芯材的乳酸菌起保护作用[18]。黄洁等[19]研究表明，羧基作为活性基团，能够与很多物质发生醚化和酯化反应，形成稳定结构。姬松茸多糖的主要成分为β-葡聚糖[20]，含有大量的羧基，且姬松茸多糖具有一定黏性，可以填充微胶囊的微孔。壳聚糖是一种聚氨基多糖，其侧链结构含有大量的伯氨基，带正电荷，易与带负电荷的海藻酸钠形成聚电解质膜[21]，且带负电荷的壳聚糖也更易与带负电荷的肠上皮细胞结合，提高肠道吸附性[22]。本试验结果显示，加入姬松茸多糖会显著提高冻干后微胶囊的直径与包被率，可能是由于未加入姬松茸多糖的SL组内部壁材仅含有1.5%的海藻酸钠，而壁材浓度过低会导致微胶囊形成空心，结构脆弱[23]，无法充分包埋目标菌，导致冷冻干燥的处理对嗜酸乳杆菌产生较大损害，降低了包被率。3.3合生元微胶囊的生物活性合生元微胶囊的生物活性主要体现在保护嗜酸乳杆菌抵抗胃酸和肠胆盐的能力、能否及时释放以及是否能够促进单一抑菌物质的抑菌活性。本试验中，为研究微胶囊对嗜酸乳杆菌在胃肠道中的存活性，配置人工胃液与肠液进行体外模拟试验。结果表明，ASL1组的配方与ASL2组、SL组以及LA组具有极显著的差异性，而同样作为合生元胶囊的ASL2组配方可能是由于海藻酸钠与姬松茸浓度过高，不利于其对胃酸与肠胆盐等不利因素的抵抗作用。由微胶囊冻干前后直径的变化可知，壁材浓度的与微胶囊的直径在呈正相关，与刘丽英等[16]的结论相同。且壁材黏度增加的情况下，在同样的转速下对于凝胶分子的分散能力会有所减弱，使粒径增加[24]。而ASL2组微胶囊在冻干的过程中可能由于过度的皱缩导致其表面结构破坏，暴露出包埋的嗜酸乳杆菌，导致其在胃酸和胆盐的影响下活性下降。微胶囊在肠道中的释放性是评价微胶囊功效的重要指标之一，过早或过晚释放均可影响其在肠道中发挥作用。本试验中，3组微胶囊均在2 h处释放了最多的活菌。但由于胆盐对嗜酸乳杆菌的活性具有一定的影响，各组的活菌数在2~4 h之间均有所下降。Cook等[25]研究表明，食物在小肠中需要消化3.2 h。因此，合生元微胶囊在2 h处达到最大释放点，不影响嗜酸乳杆菌发挥生物功效。姬松茸多糖进入肠道后可发挥提高免疫力、抗肿瘤、抗氧化、降血糖以及抗炎等功效[26]，也可以发挥抗菌活性。姬松茸多糖对金黄色葡萄球菌与大肠杆菌具有明显的抑菌效果[27]。研究表明，姬松茸多糖对革兰氏阳性菌的抑制效果优于革兰氏阴性菌[28]。本试验中，牛津杯抑菌试验结果显示，姬松茸多糖对肠炎沙门氏菌的抑菌效果低于大肠杆菌，验证了上述研究结果。本试验采用牛津杯抑菌法，测试合生元的抑菌性是否强于2种组分各自的抑菌活性。研究表明，嗜酸乳杆菌对沙门氏菌和大肠杆菌均具有抑菌活性，且对沙门氏菌的抑菌性强于大肠杆菌[29]，与本试验结果一致。本试验结果显示，姬松茸多糖可产生抑菌作用，也可促进嗜酸乳杆菌生长，增加抑菌物质产生，达到组成合生元协同抑菌的作用。研究表明，合生元微胶囊是一种应用前景良好的替抗饲料添加剂[30-31]。目前，对姬松茸多糖[4,32]以及嗜酸乳杆菌[33-34]在生产养殖环节的添加效果已有研究，且乳酸菌微胶囊在饲料中的添加可显著提高饲料转化率，改善肠道菌群[35-36]。但姬松茸多糖与嗜酸乳杆菌组成的合生元以及合生元胶囊在养殖方面的应用还未见报道。本试验首次使用姬松茸多糖与嗜酸乳杆菌组成合生元并制成微胶囊，为姬松茸多糖后续的应用提供思路。4结论本研究使用姬松茸多糖与海藻酸钠组成复合壁材，包被嗜酸乳杆菌形成合生元微胶囊，既改善了微胶囊的包被率，还在不影响肠道释放的前提下，有效地保护了嗜酸乳杆菌，减弱受胃液与胆盐的不利影响，增强了存活率和抑菌活性。