利用微生物诱导碳酸钙沉积(MICP)的方法进行砂柱固化试验研究并检测其固化效果是一种最常用的MICP室内试验研究方法．如今对于砂土的MICP灌浆加固试验，固化强度最高可达10 MPa以上[1-2]，固化后砂柱的渗透性通常会由10-4 m/s量级降低至10-7 m/s量级[3]，抗剪强度和抗液化强度相较于固化前也都显著提高[4-5]，微生物诱导生成的碳酸钙沉积量可占到砂柱质量的20%以上[6]．然而现有的研究同样显示[7-8]，这样的固化效果通常并不是全局性的，MICP试验的固化结果不均匀性问题较为明显．产生固化不均匀现象的主要原因是MICP固化反应所涉及的脲酶催化尿素水解和碳酸钙晶体沉积的两个反应发生速率都很快，在注浆后较短的时间内即可完成碳酸钙沉积．快速沉积会堵塞胶结液渗入的通道，而胶结液的堆积又会促进局部的MICP反应，从而加剧固化的不均匀性．大量研究已证实：在同样处理条件下，选用级配良好的砂土会比级配不良的砂土得到更好的固化效果[9]，且适当提高砂土的初始密实度也有助于提高整体的固化强度[10]．这意味着以粗砂代替良好级配的砂土进行MICP试验，从加大砂土颗粒的孔隙入手去解决局部堵塞过快问题的思路走不通；因此，须要从反应原理入手，寻求有效调控MICP过程的方法．已通过前期试验探究证实了将脲酶抑制剂正丁基硫代磷酰三胺(NBPT)引入MICP反应中是一种切实可行的方法[11]，试验结果显示：NBPT在反应过程中会明显延缓碳酸钙完成沉积所需的时间，且并未观测到适宜浓度的NBPT对MICP作用造成负面影响．为了进一步探明NBPT在该反应中发挥的作用，将NBPT应用于MICP固化砂柱试验，并对固化后的试样进行能谱分析检测、扫描电镜检测及X射线衍射试验检测，对检测结果进行进一步分析，结合相关研究中的反应原理和一些自然存在的现象加以佐证，探讨NBPT作用于MICP固化反应所涉及的作用机理及其对碳酸钙沉积产生的影响．1 试验材料及方法1.1　菌液培养本试验所采用的细菌为巴氏芽孢杆菌，菌种冻干粉采购自中国普通微生物菌种保藏管理中心 (China general microbiological culture collection center，CGMCC)，菌种编号为1.3687．细菌培养基的成分及配比见表1，表中固体培养基为菌种活化培养基，液体培养基为细菌扩大培养使用的培养基．培养基的pH值使用1 mol/L的NaOH溶液滴定调节至8.5．10.13245/j.hust.220201.T001表1培养基成分的体积质量成分体积质量/(g•L-1)固体培养基液体培养基酵母提取物20.0020.00NH4Cl10.0010.00MnSO4•H2O0.010.01NiCl•6H2O0.240.24琼脂15.00—按照表1的配方配置好足量的液体培养基，于高压灭菌锅中设定121 ℃灭菌30 min，灭菌完成后在无菌环境中冷却至室温即可进行细菌接种．完成接种后将菌液置于摇床上，以160 r/min的转速在30 ℃恒温条件下培养24 h，培养基溶液变浑浊即完成扩大培养，此时的菌液便可取用开始注浆．1.2　胶结液胶结液主要为MICP固化提供尿素和钙离子来源．本研究的钙源选用氯化钙溶液，与尿素保持浓度1:1混合作为灌浆胶结液，胶结液浓度设定为1 mol/L[12]．由于NBPT为不易溶于水但可溶于尿素溶液的有机物，因此在使用NBPT的试验组中，将NBPT与胶结液充分混合后共同注入待固化砂土中，试验中标注的NBPT百分比浓度用量指的是溶液中所含NBPT物质的量占溶液中尿素物质的量的百分比，下文中均简称为NBPT摩尔分数．具体用量详见表2，表中n为实验组别．10.13245/j.hust.220201.T002表2砂柱试验方案n氯化钙溶液浓度/(mol•L-1)尿素溶液浓度/(mol•L-1)抑制剂NBPT摩尔分数/%N0110.00N1110.01N2110.05N3110.10N4110.50N5111.001.3　试验方案本试验采用厦门ISO标准石英砂，属于级配良好砂土，颗粒级配曲线如图1所示，图中：D为颗粒粒径；k为相应粒径在总量中的百分比．使用特制模具装填砂柱，模具内径38 mm，砂柱高度80 mm．试验分别选取5组NBPT浓度作为试验组，另设一组不加NBPT的空白对照组，详细数据见表2．为确保细菌尽可能吸附留存在砂柱内，使用蠕动泵向每个试样内注入35 ml菌液，流速控制为5 mL/min[13]，完成注菌后静置3 h以上再进行胶结液注浆．由于NBPT对反应的调控作用使得注入胶结液时无须通过控制低浓度低速率注浆的方式来防止局部堵塞，因此注入胶结液时不采用蠕动泵，可直接使用注射器注浆或用玻璃棒引流，同时为防止不控制流速注入的胶结液对砂柱试验顶部的反复冲刷，注浆时在砂柱顶部放置一块厚度5 mm的透水石．在一个试验周期内，菌液及NBPT溶液均只注入一次，而尿素与氯化钙溶液组成的胶结液则每隔24 h注入一次，连续处理8 d，每次注浆量均为35 mL(测得砂柱孔隙饱和约需30 mL水，为确保注浆液充分填充孔隙，单次注浆量设定为35 mL)．10.13245/j.hust.220201.F001图1砂土颗粒级配曲线1.4　检测方法注浆完成后将试样静置24 h，随后开始进行后续试验测试．拆模后先使用去离子水反复冲洗固化砂柱，将砂柱内残余溶液离子及可溶性杂质去除，确保后续微观测试所得结果清晰准确．然后将各组洗净的试样以50 ℃低温烘干，每组选取3个平行试样进行无侧限抗压强度试验和生成物含量测定试验．在对试样的微观检测分析方面，选择采用扫描电子显微镜(SEM)、能谱分析(EDS)和X射线衍射法(XRD)，分别对试样进行组分和微观形貌的分析．2 试验结果2.1　固化效果图2为各组试样平均无侧限抗压强度和生成物质量占比，直观地反映了各对照试验组中NBPT摩尔分数对经MICP固化后的砂柱无侧限抗压强度和生成物含量的影响，图中：ρ为平均无侧限抗压强度；c为平均生成物质量占比．由图2可知：在引入NBPT参与MICP反应的各组试样中，无侧限抗压强度随NBPT摩尔分数变化会产生明显的差异．当NBPT摩尔分数处于0.01%~0.05%范围内时，NBPT对固化后砂柱的无侧限抗压强度影响较小．随着NBPT摩尔分数的继续增加，无侧限抗压强度开始呈现明显的上升趋势．且这一提升效果会在NBPT摩尔分数为0.1%左右达到峰值，之后若进一步提高NBPT摩尔分数则会使固化后试样的抗压强度逐渐降低，甚至比不掺入NBPT时砂土试样的要低．相较于无侧限抗压强度的大幅变化，生成物含量的数值变化没有显著的增加，但总体变化趋势与强度变化趋势保持一致．10.13245/j.hust.220201.F002图2各组试样平均无侧限抗压强度和生成物质量占比2.2　生成物的微观形貌为了从微观层面探究掺入NBPT对MICP反应的生成物的影响，本研究采用扫描电镜对反应生成物的微观结构和形貌进行了观测．图3为不同处理方法下生成物微观形貌的扫描电镜成像图．由图3可知：常规的MICP固化试验的产物是方解石晶体，其晶体颗粒呈方形且排列致密，成像清晰表面无多余附着物(如图3(a)所示)．然而，当掺入了NBPT后，生成物的形貌发生了很大变化(如图3(b)所示)．两个图中的样品都被放大了2 000倍，在同样量级水平下观测可以明显看出，图3(b)中生成的晶体颗粒尺寸要小得多．此外，其晶体颗粒的排列并不像图3(a)中那样呈现出清晰致密的晶体簇聚集，而是看似有一些黏性物质附着在这些小晶体颗粒上将其完全包裹．显然，当NBPT参与反应时，不仅形成了碳酸钙微晶颗粒，沉淀中还包含了有机物．从图3(a)可看出：当未掺入NBPT时，本试验中MICP反应生成的碳酸钙晶体的粒径约为10 μm；而当参与MICP反应的NBPT摩尔分数为0.1%时，生成的碳酸钙晶体粒径仅为1~2 μm(如图3(b)所示)．另一方面，当NBPT摩尔分数为0.5%时，生成物的主要成分仍是方形碳酸钙晶体簇，同时还含有少量的球状碳酸钙晶体(如图3(c)所示)．当掺入的NBPT摩尔分数达到1%时，生成物的主要成分将不再是方形的方解石晶体，而是变成了几乎被黏性物质覆盖的球状碳酸钙晶体(如图3(d)所示)，因此可得出结论：掺入不同摩尔分数的NBPT会改变MICP固化反应产生的碳酸钙晶体的颗粒大小和晶体形貌．10.13245/j.hust.220201.F003图3生成物微观形貌的扫描电镜成像图2.3　生成物组分为了探究在NBPT参与下MICP反应生成物的组分，对生成物进行了能谱分析和X射线衍射试验分析．能谱分析结果如图4所示，图中：E为X射线能量值；N为计数器接收到的信号强度．当NBPT加入反应后，生成物中所含元素为Ca，C，O和Cl．由于在进行EDS测试前待测样品已经用去离子水反复冲洗以确保去除附着在固化样品表面的可溶物，因此可以认为生成物中含Cl元素的物质的水溶性很差，属于有机物．这也印证了扫描电镜结果所显示的在NBPT的参与下生成物呈现出了有机物和碳酸钙晶体的共聚状态．从无侧限抗压强度和SEM结果可以得出，这样的共聚结构的胶结性能强于常规MICP处理方法所生成的纯碳酸钙晶体团簇．10.13245/j.hust.220201.F004图4NBPT摩尔分数为1%时生成物能谱分析结果图5为生成物X射线衍射图谱，图中：2θ为X射线扫描角度；I为衍射峰的信号强度，信号强度的峰值为矿物的参考判断依据．由图5可知：在NBPT摩尔分数较低的情况下，MICP反应产生的碳酸钙晶体大多为方解石．当掺入NBPT摩尔分数达到1%时，生成的晶体绝大部分为球霰石，而当掺入NBPT摩尔分数为0.5%时，反应生成的晶体为方解石和球霰石．这一结果为引入NBPT将改变MICP固化反应生成的碳酸钙晶体形态的推断提供了进一步的证据．此外，这一微观层面的观测结果也可以对固化后砂柱的无侧限抗压强度和生成物含量的变化趋势给出合理的解释．10.13245/j.hust.220201.F005图5生成物X射线衍射图谱1—NBPT摩尔分数为0.1%，方解石；2—NBPT摩尔分数为1%，球霰石；3—NBPT摩尔分数为0.5%，方解石与球霰石共存．3 结果分析3.1　NBPT对MICP反应生成物的影响X射线衍射试验分析检测结果显示，当NBPT摩尔分数为0.1%时，析出的晶体虽然尺寸显著减小，但其晶型仍为方解石．但当掺入的NBPT摩尔分数为1%时，生成的碳酸钙晶体形态变为球霰石，而当NBPT摩尔分数处于两者之间时，生成物为方解石和球霰石．由此可推断，NBPT的存在干预了球霰石向方解石的转化．球霰石是一种热力学不稳定的碳酸钙晶体形态，在常温常压下易转化为方解石，NBPT在MICP反应过程中产生的窗口期可能涉及影响球霰石向方解石转化的过程．有研究显示，有机大分子物质对球霰石的晶体形态能够起到稳定作用[14]，NBPT作为一种有机大分子，同样有此作用效果．这意味着当有更多的NBPT分子参与MICP反应时，反应生成的球霰石晶体形态会受到影响形成相对稳定的状态，不易转化为方解石，因此NBPT摩尔分数为1%的试验组中生成物会基本呈现球霰石形态．而球霰石的结构强度不如方解石高，且球霰石相较于方解石更易溶解，在对固化后试样进行冲洗烘干的过程中可能会有部分球霰石晶体流失，这可能是当MICP反应中掺入的NBPT摩尔分数超过一定量之后，最终的固化产物无侧限抗压强度和生成物总量反而会下降的原因．结合EDS分析结论，生成物中含有C，O，Ca和Cl元素，由于自然界中Cl几乎不可能与Ca，C和O几种元素组成不溶性无机盐，因此含有Cl元素的沉淀物只可能是含氯有机物．该有机物在沉淀中的作用相当于胞外聚合物EPS，与碳酸钙晶体形成共聚物，提高生成物整体的胶结水平．3.2　NBPT对MICP碳酸钙沉积过程的作用机理当NBPT作用于MICP反应碳酸钙沉积阶段时，主要是作为一种有机质对碳酸钙晶体沉积的形貌产生影响．研究表明：在自然界的生物矿化过程中，矿物结晶形成的颗粒形状大小及矿物晶体形态在很大程度上会受到环境中有机质的调控影响[15]．文献[13]对生物矿化过程中有机和无机界面的接触原理进行了研究，发现有机质的界面处阴离子浓度高于溶液中整体的阴离子浓度，而此处附近钙离子的浓度也明显高于溶液中的钙离子浓度，并且在这个界面附近聚集的离子浓度与溶液本身所含离子的浓度无关，这样的聚集现象是有利于晶体的形成和生长的．NBPT在其中所发挥的调控作用与其自身浓度有关：当掺入NBPT摩尔分数小于0.1%时，对碳酸钙沉积的调控作用主要表现为显著减小碳酸钙晶体的颗粒尺寸，即在这样的反应条件下受NBPT控制析出的沉淀是碳酸钙微晶粒；当掺入摩尔分数为0.5%左右时，NBPT会控制析出部分晶体形貌为球霰石的碳酸钙晶体，且当摩尔分数为0.1%～1%范围内时，MICP反应最终生成的晶体为方解石微晶粒和球霰石的共聚体．当NBPT摩尔分数大于1%时，反应生成的沉淀完全呈现球霰石的晶体形貌．除了对碳酸钙晶体沉积过程进行调控，NBPT同样与生成物中有机质的存在有密不可分的关系．由于该有机质的生成涉及复杂的有机化学理论，对于生成物中有机质详细组分的分析鉴别和对NBPT参与该反应方程式的推导不属于本研究领域的内容，因此本研究并未从分子层面解释NBPT是如何参与有机物的生成的．但通过试验结果的验证，可以推测，在MICP反应中掺入NBPT作为添加剂与反应生成物中含有包裹碳酸钙晶体颗粒的有机质这二者之间存在因果关系，可以结合试验现象解释NBPT的作用机制．随着NBPT的降解，原本与之结合的脲酶活性被释放继续参与尿素水解反应，NBPT分解出的有机分子则可能与水分子、氯离子结合形成新的官能团替代，生成新的有机物，其过程可类比理解为类似醌类有机物降解生成酚类有机物．而新生成的有机物会发挥黏附碳酸钙的作用，与正在发生沉积的碳酸钙晶体形成共聚体共同沉积成更加稳定的结构，有机物的胶结作用也会进一步提高共聚生成物的胶结水平．自然界中也确实存在这类结构，如图6所示的珊瑚礁．可以看出MICP反应在NBPT的作用下产生的生成物结构与一些珊瑚礁的构成很像，而珊瑚礁是由碳酸钙和有机质构成的，这也印证了本研究关于生成物及其作用效果的推论是有据可考的．10.13245/j.hust.220201.F006图6生成物微观形貌与珊瑚礁形貌对比图4 结论在将NBPT引入MICP进行试验的基础上，结合所观测到的试验现象和试验结果，尝试综合探讨NBPT在MICP固化作用所涉及的反应中发挥的作用，同时借鉴现有的相关生物化学反应原理及自然界中存在的一些现象加以佐证，探讨了NBPT在MICP反应过程中对碳酸钙沉积的影响并初步揭示了其作用机理，所得结论如下．a. NBPT作用于MICP反应过程中，可直接调控反应生成碳酸钙晶体的大小和形貌，从而在宏观层面影响生成物的含量及MICP的胶结效果，且该调控作用与掺入NBPT摩尔分数相关．b. 当NBPT摩尔分数不高于0.1%时，主要控制生成方解石微晶粒．在同等试验条件下，无NBPT参与的MICP反应所生成的方解石晶体尺寸大小是有NBPT参与所生成的方解石晶体粒径的10倍，微晶粒排列更加致密，可提高MICP胶结水平．c. 当NBPT摩尔分数高于1%时，反应产生的碳酸钙晶体为球霰石形态，且球霰石在NBPT的作用下能够稳定存在，不易转化为方解石，但球霰石形态的碳酸钙强度不如方解石形态．d. 当NBPT摩尔分数介于0.1%和1%之间时，生成的碳酸钙晶体为方解石和球霰石共聚的稳定状态．e. NBPT还会参与生成有机物沉淀，该有机物具有黏附性，可与碳酸钙晶体形成稳定的共聚体，进一步提高MICP反应生成物的胶结效果．