在自然环境中，99%以上的微生物无法通过传统的技术在实验室实现纯培养[1]．天然微生物体系大多以混合菌群的形态存在，通过代谢物或信号分子交换等方式相互依存，在不同细胞间进行分工协作，共同完成复杂工作，并更好地适应环境变化[2]．人类对多细胞体系的应用已有几千年的历史，例如中国传统的生物发酵生产白酒、酱油等，即为典型的多菌种(细胞体系)参与的复杂过程[3-4]．当前污水处理厂的主流工艺——活性污泥法，则属于多细胞体系在环境领域的典型应用，是微生物学和环境工程相结合的结果．由于经过长期进化已经适应了特定的生活环境，因此天然微生物多细胞体系在稳定性上有一些优势，但利用在自然选择下形成的微生物多细胞体系进行生物处理，往往存在效率低、周期长及可控性差等问题，同时其应用的普适性与灵活性也受到较大限制[5]．近年来，合成生物学的迅猛发展给多细胞体系的应用指明了新的方向．合成生物学是以工程学思想为指导，通过从头设计和构建，对天然生物系统进行重新设计与改造[6]．人工微生物多细胞体系是基于合成生物学理念构建的合成微生物菌群，相比传统混菌体系或单一微生物具有更高的鲁棒性与稳定性[7-9]，特别适合于复杂环境的应用．本研究综述了近年来人工微生物多细胞体系在环境领域应用的最新进展，并剖析了人工微生物多细胞体系面临的诸多挑战及针对性的解决方案．1 人工微生物多细胞体系的优势与单一微生物或传统混菌体系相比，人工微生物多细胞体系是基于细胞间通信、代谢分工、能量与物质转移和电子传递构建的合成微生物体系，其组成更明确、功能更稳定[10-11]，因而可实现天然微生物体系无法完成的任务．具体而言，人工微生物多细胞体系的优势主要体现在以下几个方面[8，12-15]：a. 与单一微生物相比，人工微生物多细胞体系通过细胞间沟通、交流等相互作用，具有更高的稳定性，对外界环境扰动具有更强的适应性和鲁棒性；b. 人工微生物多细胞体系中，通过不同细胞间的劳动分工，可完成更为复杂的任务；c. 相较于单一微生物，人工微生物多细胞体系可将复杂的代谢途径进行划分，通过代谢产物交换或专有信号分子传导等方式降低细胞的代谢负荷；d. 人工微生物多细胞体系具有简化性与可定义性等特点，可根据研发的需要对其组成成员进行定义，是天然微生物多细胞体系的简化模型；e. 与天然微生物多细胞体系相比，人工多细胞体系具有明确的遗传特性，可控性较强，通过系统生物学和合成生物学方法能实现其结构与功能的精准控制与监测(见图1)．10.13245/j.hust.221001.F001图1人工微生物多细胞体系的优势2 人工微生物多细胞体系的构建与调控2.1　人工多细胞体系的设计与构建当前，人工多细胞体系的研究尚处于起步阶段，应用合成生物学理念，以设计-构建-测试-学习循环为核心[16]，逐级解决人工多细胞体系构建与应用中面临的挑战，将推动人工多细胞体系基础理论的完善与发展，进而实现对其组成和功能的精准调控和优化．设计与构建一个结构与功能稳定的人工多细胞体系，须要综合考虑多个影响因素，可参照自然界物种间的相互作用关系(如共生、协作等)，运用系统生物学和合成生物学的方法和理论，理性设计与构建具有实用价值的人工多细胞体系[17]．人工多细胞体系的设计与构建通常有两种策略[16]．a. 自上而下(top-down)：即不是预先选定物种构成和代谢途径，而是通过环境参数(如底物负载率、氧化还原条件等)的选择或优化，利用生态选择强制现有微生物体系来执行所需生物过程并实现特定功能，多细胞体系成员最终由从特定的复杂微生物群落中挑选的关键物种构成[18-19](见图2(a))．b. 自下而上(bottom-up)：即通过预测特定的代谢网络，设计合成菌群来获得具有特定功能的人工多细胞体系，多细胞体系成员从分离和/或基因工程微生物资源库中选择，这些微生物可能具有所需的特性，但不一定具有共同的环境来源[18](见图2(b))．10.13245/j.hust.221001.F002图2自上而下和自下而上的人工微生物多细胞体系构建方法基于传统自上而下的方法设计构建的多细胞体系应用于宏观尺度如废水处理和生物修复方面已取得了广泛的成功[16]，但该方法常常忽略了体系原位代谢网络和成员间复杂的相互作用，限制利用分子尺度的机理分析对体系进行优化；因而由各种合成生物学工具推动的自下而上方法已逐渐成为构建人工多细胞体系的常用方法[20]，现阶段自下而上的设计实例大多为基于具有工程依赖性的模式生物(如大肠杆菌和酿酒酵母)构建的简单群落[16]．未来则须在对非模式物种的新陈代谢和相互作用机理深入了解的基础上，设计构建由更多的非模式物种组成的多细胞体系．综上所述，自上而下与自下而上的设计方法，目前都面临不同程度的技术挑战，其共同之处在于人们对复杂微生物体系成员间的互作网络关系缺乏足够认知[21]．未来成功设计和构建人工多细胞体系(如人类微生物组或活性污泥多细胞体系)须要两种方法的合理结合．混合方法可同时选择未确定的混菌和已确定的菌群来实现所需功能，将基于过程的模型与利用宏组学信息构建的代谢模型相结合来模拟生态系统过程、质量平衡和代谢物通量，并使用基因组衍生信息来开发群落选择策略[16,22]．随着单细胞技术和系统生物学工具的不断进步，人们将会对环境微生物群落有更好的了解，这将有助于利用环境微生物设计鲁棒性更好的多细胞体系．2.2　人工多细胞体系中的相互作用及其调控尽管人工微生物多细胞体系在生物合成和环境生物修复中已展示出广阔的应用前景，但在如何进一步提升人工多细胞体系稳定性和可控性，以更好实现其功能方面仍面临巨大挑战．在人工多细胞体系中，不同微生物种群之间存在着多种相互作用关系，对微生物体系不同种群之间相互关系的解析将有助于我们进一步理解与应用混菌体系，而这些相互关系主要依赖于不同细胞间物质、能量、信息等方面的通讯与交流[23-24]．研究者强化人工多细胞体系的核心功能，以实现底物到目标产物的高效快速转化[25-26]．2.2.1　人工多细胞体系中微生物种群间的相互关系人工多细胞体系的微生物成员中广泛存在着多种复杂相互作用．微生物种群间的相互关系决定了人工多细胞体系的稳定性，并影响体系的行为及功能．微生物之间的关系可分为正相互作用(positive impact，+)、负相互作用(negative impact，-)和零相互作用(neutral，0)等三类，具体地可分为互利共生(+/+)、偏利共生(+/0)、寄生或捕食(+/-)、中立共生(0/0)、偏害共生(-/0)和竞争关系(-/-)等6种[27](见图3)．由于菌种间存在复杂的交互关系，因此在构建人工多细胞体系时要综合考虑参与菌种的功能、分布和生长环境等诸多因素[28]，通过理性设计构建人工多细胞体系，而不是将多种微生物进行简单的随机组合，并进一步通过改变物质与能量代谢作用、细胞间通信、环境参数和空间结构等方式对这些相互作用进行调控[28-31]，以实现特定功能．10.13245/j.hust.221001.F003图3微生物之间的相互关系2.2.2　基于物质与能量代谢作用的人工多细胞体系调控人工多细胞体系的微生物之间可以通过物质、能量的传递进行交流，共享资源实现对多细胞体系结构与功能的调控．以藻菌人工多细胞体系为例，研究发现：微量营养素(如维生素)、大量营养素(如氮、碳和植物激素)通常在藻类和细菌之间交换，这种代谢弥补的生存方式使得藻菌形成基于营养互补的互利共生关系，使得藻菌体系更稳定，从而发挥其在环境生物治理、高价值物质生产等领域的功能[32-33]．近年来，合成生物学和代谢工程的发展为人工多细胞体系功能优化提供了新的手段，通过理性设计与构建人工多细胞体系，让不同的微生物种群承担不同的代谢功能，并进行工程改造及操控，建立代谢网络，进行劳动分工，以实现特定目标[15]．2.2.3　基于细胞间通信的人工多细胞体系调控除了基于代谢作用实现人工多细胞体系的结构与功能调控外，通过信号分子介导的细胞间通信也能调节多细胞体系的组成，调控物种间相互作用，进而实现复杂任务的分工与执行．细胞间通信的设计和整合使得研究人员能够自主理性设计人工多细胞体系的行为和功能[34]．群体感应(QS)是种内和种间最常见的通信机制之一．合成生物学的迅猛发展使QS成为协调多细胞体系复杂行为的最具吸引力的常用方法[35-37]．目前，已知的QS系统信号分子主要可分为三大类：革兰氏阴性菌分泌的酰基高丝氨酸内酯(AHLs)，革兰氏阳性菌分泌的寡肽(AIP)，同时调控革兰氏阴性菌和阳性菌实现细菌种间交流的呋喃硼酸二酯(AI-2)．其中，基于小分子AHLs的群体感应系统，因其简单的遗传结构已成为多细胞体系中细胞通信的首选技术[38]．例如，罗峰等设计了基于AHLs类信号分子的生长控制机制，以C7-HSL，C8-HSL和3-oxo-C10-HSL为信号分子，对活性污泥多细胞体系进行代谢调控，提高了系统的硝化性能[39]．2.2.4　基于环境参数和时空分布的人工多细胞体系调控人工多细胞体系的周边环境(如温度、pH值和氧气等)对微生物物种间相互作用、体系功能及稳定性也有着重要的影响，因此调节环境参数是调控人工多细胞体系结构和功能的另一个有效方法．Hu等通过使用两个群体感应信号传导电路，设计构建了一个环境敏感的人工多细胞体系，发现改变环境中的抗生素水平及调节初始细胞密度可导致消亡、互利共生、偏利共生、共栖等相应的种群动态变化[40]．最近，时空有序分布这一概念在多细胞体系的研究中备受关注．通过调控多细胞体系成员的时空动态行为，促进菌群的时空有序分布，有利于提升物种间物质、能量和信号的传递效率，使菌群之间进行更好地协同互作，并提升多细胞体系对外界环境的适应性[41]．Chen等提出了一种新颖的基于氧驱动的多壳层好氧颗粒污泥体系快速构建方法，以功能菌-塔宾曲霉菌Aspergillus tubingensis介入构建限域空间，促进多细胞间分工协作，提高好氧颗粒污泥对环境胁迫的适应性和稳定性，该体系具有更高的污染物去除性能和更强的抗进水负荷冲击能力[42]．近年来，研究者开发了多种新型物理分离技术如微流控设备、生物打印、成型/封装等应用于人工多细胞体系中菌群的时空分布和控制．例如，Connell等开发了一种微观三维(3D)打印策略，可以在人工多细胞体系内以空间隔离的方式排列多个微生物物种[43]．该技术可以实现嵌套排列，其中一个物种围绕另一个核心种群形成一个壳．Kim等以氯酚鞘氨醇杆菌Sphingobium chlorophenolicum为核，以罗尔斯通氏菌Ralstonia metallidurans为壳，构建核壳结构的多细胞体系，该体系实现了对五氯苯酚(PCP)和汞离子(Hg(II))混合物的同步去除[44]．3 人工多细胞体系在环境领域的应用表1为人工微生物多细胞体系在环境领域的应用实例．由于人工多细胞体系具有诸多优势，已在废水处理、土地修复、有机废物能源转化等环境工程领域得到广泛的应用．10.13245/j.hust.221001.T001表1人工微生物多细胞体系在环境领域的应用处理对象人工微生物多细胞体系构成研究亮点文献废水处理模拟市政污水普通小球藻与地衣芽孢杆菌更高的NH4+和TP去除率[45]模拟养猪沼液链带藻与有机污染物降解混合菌株(芽孢杆菌、假单胞菌、雷氏菌等)C，N，P去除率提高[46]模拟市政污水绿藻与活性污泥显著提高N，P去除率[47]高氨氮人工废水微生物菌剂BMc-1与短程硝化-反硝化污泥脱氮性能显著提升[48]土壤修复重金属污染填埋场土壤子囊菌、担子菌、子囊菌-担子菌三种多细胞体系复合重金属同步去除[49]混合活性偶氮染料污染土壤阴沟肠杆菌与枯草芽孢杆菌成本低、简单、可靠、可复制且节省劳力[50]林丹和铬复合污染土壤链霉菌M7，MC1，A5和土库曼拟青霉AB0成功修复林丹和铬复合污染土壤[51]有机废物能源转化未脱毒稀酸预处理的麦秆浆里氏木霉，酿酒酵母和树干毕赤酵母共发酵体系乙醇产率高达67%，滴度高达10 g∙L-1[52]食物和蔬菜垃圾瘤胃菌群与厌氧污泥对进料波动适应性更好，长期产沼性能稳定[53]淀粉废水厌氧污泥与栅藻同步产氢产脂，显著提高能量回收率和COD，N和P去除率[54]3.1　污水处理当前，世界各国均受到不同程度的水污染困扰，水资源稀缺问题也日趋严重．针对水质污染问题，主要的任务是去除氮、磷和有机污染物等[55]．活性污泥法是当今应用最为广泛的废水生物处理工艺，活性污泥中包括成千上万种微生物，是典型的由不同物种构成的天然多细胞复杂体系，随着我国对环境质量要求的不断提高，对生活、工业和养殖废水处理水平的要求逐年提升，天然活性污泥微生物菌群已经难以满足技术发展的需求[1]，利用合成生物学理念与技术方法构建人工微生物多细胞体系可为污水处理提供了一种有效可行的途径．藻菌混合微生物体系是目前应用较多的人工多细胞体系，藻菌通过营养基质交换、细胞间通信、水平基因转移等方式产生相互作用，构建稳定的多细胞藻菌共生体系，增强其吸收、转化、清除和降解环境污染物的能力，应用于废水处理已取得了一定的成果[56-57]．自20世纪90年代以来，研究者一直重视利用藻菌共生体系从废水中去除氮、磷等营养物质[58]．相比于单藻或单菌体系，藻菌多细胞共生体系可显著提高营养物质(氮、磷)的去除效率．与仅使用普通小球藻或地衣芽孢杆菌相比，二者构成的藻菌复合体系可使NH4+和TP的去除率提高为78%和92%，远高于单藻(分别为29%和55%)及单菌(分别为1%和78%)[45]．藻菌多细胞体系对废水中有机污染物的处理也有较好效果，利用细菌和微藻之间的相互作用可促进有机污染物的降解，为微藻的光合作用提供充足的无机碳源从而促进微藻的生长和废水中氮磷的去除．例如，利用链带藻Desmodesmus sp．CHX1和有机降解混合菌株(芽孢杆菌Bacillus、假单胞菌Pseudomonas、雷氏菌Ralstonia等)构成的藻菌体系处理养猪沼液，其总有机碳、氨氮和总磷的去除率比单藻系统分别增加了5.27%，3.41%和5.74%[46]．近年来，利用微藻与常规活性污泥构建新型藻菌人工多细胞体系处理污水日益引起世界各国的关注．Tang等[47]在序批式生物膜反应器(SBBR)中添加藻类，形成一种新型的藻-菌共生系统(ABS)．与SBBR相比，藻菌共生系统ABS的总氮、磷去除率分别从38.5%和65.8%提高到31.9%和89.3%．在藻菌共生体系中，微藻通过光合作用产生溶解氧用于驱动细菌处理过程，降低操作成本，并限制机械通气条件下污染物挥发的风险．反过来，细菌细胞通过呼吸提供藻类生长所需的次生代谢物和无机碳源[59](见图4)．在实现污水生物处理的同时，还可收获生物质生产高附加值的生物能源、生物产品[60-61]．10.13245/j.hust.221001.F004图4藻菌共生污水处理系统中藻、菌相互关系及各自职能尽管藻菌多细胞体系展现了诸多优势，但微藻生长需要足够的光照仍极大限制了该生物修复技术在污水处理方面的应用．最近的一个新的发展趋势是利用微生物菌剂添加到活性污泥进行生物强化中构建人工多细胞活性污泥来提高天然活性污泥对特定污染物的处理效率[62]．吴岩等[48]将新型复合微生物菌剂BMc-1投加到A/O短程硝化-反硝化脱氮系统中，结果证明：接种后活性污泥中微生物量、丰度及多样性提高，形成一个稳定的人工多细胞活性污泥系统，显著提升了其对高氨氮废水的处理效率．为了更好地发展人工多细胞活性污泥污水处理技术，未来可针对生活污水、工业废水及养殖废水等不同应用场景，综合考虑水质特点及环境因素，利用合成生物学技术个性化定制复合人工活性污泥，提升不同工况条件下人工多细胞活性污泥性能，研发基于活性污泥人工合成多细胞体系的污水处理工艺及装备．3.2　土壤修复随着工农业的迅速发展，土壤污染问题日益严重．土壤一旦受到污染特别是受到重金属或有机污染物的污染，其污染物很难被自然消除．在污染土壤修复的研究实践中发现，物理和化学修复方法成本较高，且易造成二次污染；微生物修复则具有绿色高效、经济简便、二次污染少等特点，逐渐成为土壤污染修复领域的研究热点与趋势[63-64]．近年来，已发现多种对不同金属元素、有机污染物具有较大去除潜力的微生物[65-66]；然而，实际土壤污染成分往往复杂多样，存在重金属复合污染、有机污染物复合污染、重金属-有机物复合污染等多种形式[67]，使用单一微生物难以解决问题．多细胞体系则含有多种鲁棒的污染去除菌株，可实现多种复合污染物的同步去除．例如，Hassan等比较了子囊菌多细胞体系、担子菌多细胞体系、子囊菌-担子菌混合多细胞体系对复合重金属(Cr，Cu，As，Fe，Mn)污染填埋场土壤的修复效果，发现子囊菌-担子菌混合多细胞体系对大多数重金属具有最高的去除效率，Mn，As，Cu和Cr的去除率分别达到71%，77%，52%和60%，该研究证实设计和构建真菌多细胞体系在土壤复合重金属治理中将具有广阔前景[49]．Priyanka等发现阴沟肠杆菌Enterobacter cloacae和枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis固定化共培养能有效降解土壤中的有毒混合活性偶氮染料(活性红(RR)、活性棕(RB)、活性黑(RBL))污染，脱色率显著高于采用单菌培养[50]．Aparicio等报道了采用链霉菌Streptomyces sp．MM7，MC1，A5 和土库曼拟青霉Amycolatopsis tucumanensis AB0 构建的放线菌多细胞体系去除六种不同程度的土壤林丹和Cr(VI)复合污染，14 d后，测试6种复合污染土壤中有5种得到成功修复[51]．采用自然环境中筛选的微生物构建人工多细胞体系对处理土壤复合污染物，往往存在筛选周期长、同步去除效率不高、针对性不强的缺点[68]．基因工程和合成生物学的发展促进了微生物的人工改造，甚至是重新设计，以提高其能力，使这些人工微生物成本低，可广泛应用于生物修复．利用基因工程和合成生物学技术开发功能微生物菌株，对微生物进行人工改造或重新设计，不仅可有效提高处理效率和特异性，还能增强微生物对复合污染物毒性作用的抗性．目前，针对单一类型的污染物或复合重金属或复合多环芳烃污染的基因工程菌已得到开发，但很少有基因工程菌能同步处理重金属-有机物复合污染物[69]，而且大多数基因工程菌应用尚处于实验室模型研究阶段，未来随着合成生物学技术的不断发展，将以功能菌株为核心，结合功能载体材料、生物包裹等技术，实现简单多细胞体系的全人工构建和工程化控制，有望开发出针对特定复合污染土壤环境中规模化应用的新方法．3.3　有机废物能源转化有机废物包括农林秸秆、污泥、餐厨垃圾、工业有机废水等，这些废物的有机质含量较高，和一般废物相比，更容易被微生物利用，利用微生物处理将有机废物生物转化为有用的能源产品，符合循环经济的理念，也将是缓解我国能源紧张的有效途径之一．利用微生物制备的主要生物能源包括生物乙醇、沼气、氢气等[70]．将人工微生物多细胞体系应用于有机废物的处理并生产上述生物能源已有诸多报道．例如，对于生物乙醇的生产，Brethauer和 Studer利用里氏木霉Trichoderma reesei，酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae和树干毕赤酵母Scheffersomyces stipitis构建的多细胞体系处理未脱毒的稀酸预处理的麦秆浆生产乙醇，产率高达67%[52]．Jo等采用将瘤胃菌群添加到厌氧连续搅拌槽式反应器中，与厌氧污泥构成人工多细胞活性污泥系统处理食物和蔬菜垃圾，在进料组分反复波动的情况下，与对照反应器相比，生物强化的多细胞活性污泥厌氧发酵系统呈现出更好、更稳定的产沼性能[53]．采用厌氧污泥与栅藻Scenedesmus sp．共培养处理淀粉废水同步产氢产脂，微藻-污泥多细胞体系能极大提高了能量转化率和营养物质去除率，其能量转换效率从污泥系统的15.65%提高到34.2%，COD，TN和TP的最大去除率分别达到80.5%，88.7%和80.1%[54]．虽然多细胞体系在有机废物处理及能源转化方面已经取得一定的进展，但大多数研究仍处在实验室阶段，将其应用于生物能源工业化生产中仍须要更多的大规模试验，特别是长期培养过程工艺参数优化有待进一步探究．4 结论与展望近年来，人工微生物多细胞体系因其强大的鲁棒性、稳定性、可控性在废水处理、土地修复、有机废物能源转化等方面研究进展迅速，证明其在环境生物处理领域应用潜力巨大．但目前人工多细胞体系的构建及其在环境领域的应用仍面临一些问题与挑战．a. 设计构建复杂的人工多细胞体系，须要对体系成员之间相互作用与代谢网络进行更系统深入的研究，从而为实际应用提供理论依据．b. 目前对人工多细胞体系组成与功能同时调控的能力有限，是限制其实际应用的关键问题．通过培养条件优化、劳动分工、群感效应的应用、时空有序3D菌群结构的设计及机理模型的构建与计算仿真技术的开发等策略，设计及调控人工多细胞体系的结构、行为与功能，是今后研究要关注的重点．c. 如何进一步提高人工多细胞体系的稳定性．当人工多细胞体系在生物处理中实际应用时，会面临复杂多变的环境条件，环境中原有的天然微生物群落也会与其产生相互作用，未来须发展群感效应、细胞互作、代谢偶联等新方法优化配伍人工菌群，增强人工多细胞体系在天然环境中的适应性和稳定性．d. 开发基于人工微生物多细胞体系的环境生物处理新方法．目前，人工多细胞体系的构建及应用研究多处于实验室模型研究阶段．随着合成生物学、系统生物学、生物信息学及环境工程技术的不断发展，在可预见的未来，可望实现多细胞体系的全人工构建和工程化控制，并基于人工多细胞体系理论与应用新成果，指导微生物菌剂合成，开发环境生物处理新技术新工艺，开展工程化应用及其生物安全性评估，建立可实施的人工微生物多细胞体系环境应用标准．