随着垃圾分类被纳入国家治理层面，各地生活垃圾管理条例正式实施，垃圾的干湿分类正在成为餐馆与家庭的常态，厨余垃圾将得到更科学的利用[1]．厨余垃圾总量大、产生源分散、易产生二次污染[2]，因此安全稳定处理厨余垃圾是亟待解决的环境问题，迫切须要采用新技术对厨余垃圾进行适当的处理和再利用．在目前生活垃圾源头分类大背景及相关政策要求下，将厨余垃圾进行堆肥处理具有重要意义．堆肥是在人为控制通气量、温度和湿度等条件的情况下，利用细菌、真菌等微生物将易生物降解的有机物转化为稳定腐殖质，并在高温过程中杀灭病原体的过程[3]．好氧堆肥技术成熟、成本较低，且堆肥产品可以就地农用，实现资源化利用；但厨余垃圾含水率高、孔隙率低，使得厨余垃圾堆肥仍面临许多技术挑战，如发酵周期长、有机质降解缓慢、腐熟困难等问题[4]．在厨余垃圾中掺入填充剂可以改善此类问题，常用的填充剂包括木屑、树皮、农业秸秆等．我国作为农业大国，农业废弃物年产量巨大．2015年，全国主要农业秸秆理论资源量为10.4×108 t，可收集资源量为9.0×108 t[5]，而且农业秸秆含有木质纤维素、蛋白质和脂肪等资源[6]．研究发现秸秆作为填充剂可以调节堆肥物料含水率、孔隙度，改善堆肥过程的通风、升温效果，平衡堆肥物料的营养物质，进而改善堆肥过程，提高堆肥产物质量[7]．秸秆中较高的半纤维素含量可以提高有机质(organic matter，OM)的降解率和腐殖酸类物质(humic substances，HS)的含量，而木质素含量较高可以提高堆肥腐殖质的聚合度[8]．秸秆作为填充剂对厨余垃圾好氧堆肥影响显著，研究其对堆肥中物质转化、产品质量影响具有重要意义．含氮物质转化贯穿好氧堆肥整个过程，主要包括有机氮的矿化过程、氨挥发过程、亚硝化过程、硝化过程、反硝化过程及氨同化过程等[9]．氮素在堆肥期间的转化过程不仅直接影响堆肥效率，而且与最终产品的农业价值有关[10]．堆肥主要用作肥料和植物生长调节剂，施用于农田促进植物生长．植物可利用的氮形态种类丰富，最终能供植物吸收利用的含氮物质可分为两种：无机态氮(NO3-和NH4+)和有机氮(氨基酸、蛋白质等)[11]．蛋白质和氨基酸在堆肥过程中的变化十分重要，蛋白质降解是有机氮矿化的限速步骤[12]，植物能吸收氨基酸、可溶性蛋白质等有机态营养物质，而且土壤吸收氨基酸含量的变化具有调节植物代谢途径的能力[11]．研究堆肥中的氨基酸、蛋白质等含氮物质的含量变化、转化过程及其与堆肥产品的农用价值的联系具有进步意义．文献[13]研究堆肥过程总氮、酸水解氮、NH4+、氨基糖态氮的变化，结果发现：堆肥早期，有机氮转化为NH4+，之后发生NH4+的挥发和硝化等反应，NH4+含量减少，氨基糖态氮是微生物的重要组成部分，其含量与微生物生物量有关，氨基糖态氮与酸水解氮的比例约为3%．文献[14]研究豆渣对猪粪堆肥过程中氮转化和细菌动力学的影响，认为：10%豆渣作为添加剂，可以促进细菌多样性和丰度，改善氮损失．先前对堆肥过程含氮物质的研究主要集中在矿质氮含量的变化，蛋白质氨基酸等含氮物质的变化却鲜有报道．事实上，蛋白质降解是有机氮矿化的限速步骤，氨基酸可以促进碳水化合物聚合为腐殖酸类物质[12]，其变化在堆肥中较为重要．文献[15]对比了利用不同填充剂(即花园垃圾、玉米秸秆和蘑菇底物)堆肥处理餐厨垃圾后的效果，结果发现玉米秸秆更易诱发细菌共生进而增强有机物降解和气体排放．文献[16]在玉米秸秆堆肥中分别添加蚯蚓粪和沸石，确定了细菌群落的演替和代谢功能，结果显示：蚯蚓粪和沸石的加入将提高反应温度，降低NH4+含量，增强了细菌群落的代谢能力，从而提高堆肥质量．文献[17]在猪粪堆肥时加入轧棉机废料和木屑，试验发现：木屑和轧棉机废料有助于减少堆肥过程中的气体排放，降低堆体密度和含水率，从而提高孔隙率和碳氮比．以上研究主要从气体排放、细菌群落、水分调节等方面评价填充剂对堆肥的促进作用，然而到目前为止，对于不同种类秸秆作为填充剂，堆肥过程中蛋白类物质变化的信息还很少，微生物群落功能分类认识不足，因此十分有必要从这两方面评价秸秆对堆肥过程的促进作用．本研究从典型蛋白类物质转化及微生物群落动态变化特征等方面阐明了秸秆填充剂对厨余垃圾好氧堆肥过程的促进作用，为建立厨余垃圾堆肥处理的示范工程，厨余垃圾的资源化利用提供数据支撑和新的思路．1 材料与方法1.1　试验原料好氧堆肥试验采用厨余垃圾和鸡粪作为堆肥原料，厨余垃圾取自华中科技大学校园食堂，取回后挑去筷子、塑料袋等杂质，并将厨余垃圾粉碎至糊状．鸡粪取自武汉市洪山区左岭大市场，取回后挑去鸡毛．厨余垃圾和鸡粪取回后放于4 oC冰箱保存，鸡粪和厨余垃圾主要性质见表1，表中：TN为总氮；TC为总碳．试验所用秸秆购买自江苏连云港惠丰秸秆农产品深加工店铺，烘干后使用．其中鸡粪用来提供微生物，木屑和秸秆用作填充剂．10.13245/j.hust.221012.T001表1鸡粪和厨余垃圾基本特性物质pH值含水率/%质量分数/%有机质NH4+NO3-TNTC鸡粪8.88±0.0026.9±0.564.3±0.70.006 4±0.000 10.001 0±0.000 11.927.6厨余垃圾4.51±0.0073.3±1.094.6±0.90.006 0±0.000 00.002 1±0.000 13.450.01.2　添加秸秆堆肥处理厨余垃圾试验方案设计秸秆粉碎至粒径小于1 cm，晒干后使用．本次试验设置未添加秸秆的对照组 (Control)、玉米秸秆 (Maize)、水稻秸秆 (Rice)、油菜秸秆 (Rape)、小麦秸秆 (Wheat)五组，厨余垃圾的添加比例为0.3 (g/g干基)，具体配比见表2．采用泡沫箱作为堆肥反应装置，(外径为33 cm×25.3 cm×27.5 cm，内径为26.3 cm×18.5 cm×20.5 cm)，为避免产生厌氧环境，泡沫箱每面开2个小孔(小孔面积为4 cm×4 cm)保持通风．将泡沫箱放入培养箱中，每天对堆料进行翻堆，调节培养箱湿度，不定期加入去离子水，确保物料中含水率介于50%~65%．堆肥采样时间分别为第1，3，5，8，12，17，25和35 d(鸡粪、秸秆与厨余垃圾混合后即取样，第1天样品即为混合物料)．取样前充分搅拌，确保取样均匀．采集的样品分为两部分：一部分保存在4 oC下进行理化性质测试；另一部分保存在-20 oC下进行微生物分析．10.13245/j.hust.221012.T002表2物料配比试验分组秸秆质量鸡粪质量厨余垃圾质量物料总质量对照组07603801 140玉米秸秆3807603801 520水稻秸秆3807603801 520油菜秸秆3807603801 520小麦秸秆3807603801 520g1.3　分析测试方法1.3.1　堆肥基本理化特性测试每天18:00用温度计测定堆体温度．收集的样品在105 oC烘干至恒重，测量含水率，然后使用马弗炉在550 oC灼烧4 h，测定有机质含量[18]．新鲜堆肥样品与去离子水按固液比1:10混合，在25 oC下200 r/min震荡1 h后测定pH值和电导率[19]．新鲜堆肥样品与去离子水按固液比1:10混合，在25 oC下200 r/min震荡1 h，离心后用0.45 μm滤器过滤，得到堆肥水提取液．在种子发芽盒里铺1层滤纸，加入15 mL堆肥水提取液，滤纸上放置20粒大白菜种子，发芽盒置于温度25 oC、湿度70%的培养箱中，培养72 h，测量发芽种子数量和根长，计算种子发芽指数[18]EGI，有EGI=S1R1S2R2×100%，式中：S1为堆肥组发芽种子数量；R1为堆肥组根长；S2为对照组发芽种子数量；R2为对照组根长．1.3.2　堆肥含氮物质特性测试a. NH4+含量测定．新鲜堆肥样品与2 mol/L KCl溶液按固水比1:10混合，在25 oC下200 r/min震荡30 min，离心后用0.45 μm过滤器过滤，滤液用于测定NH4+含量，NH4+采用纳氏试剂比色法测定．b. 蛋白质含量测定．从堆肥样品中提取溶解性有机物(dissolved organic matter，DOM)．新鲜堆肥样品与去离子水按固水比1:10混合，25 oC下200 r/min振荡24 h，然后10 000 r/min离心10 min，0.45 μm滤器过滤，滤液即为DOM[20]．提取的一部分DOM以Lowry法为基础，使用蛋白质检测试剂盒进行蛋白质含量测定[21]．c. 蛋白质种类测定．蛋白质类型的变化采用三维荧光光谱(3D-EEM)仪(日本，日立公司，F4600)测定．光谱的扫描速率为2 400 nm/min，发射和激发的狭缝带宽均为10 nm．发射波长范围为280~550 nm，激发波长范围为200~450 nm，增量为5 nm[20]．d. 参考文献[22]方法，采用型号为Agilent 1260高效液相色谱(HPLC)测定氨基酸含量：提取DOM冷冻干燥后，加入1 mL盐酸(0.1 mol/L)，6 000g离心10 min，然后用0.22 μm有机滤膜过滤．1.3.3　16S rRNA高通量测序试验使用磁性土壤和粪便DNA试剂盒(中国，天根生化科技(北京)公司)提取DNA．本次测序使用的引物如表3所示．10.13245/j.hust.221012.T003表3PCR扩增所用引物项目引物序列(5ˊ—3ˊ)片段长度/bp细菌16S rRNA338FACTCCTACGGGAGGCAGCAG468806RGGACTACHVGGGTWTCTAAT468Novogene(中国北京)进行了DNA样本的扩增子测序，包括删除超过一定百分比(默认为40个碱基对)的低质量碱基(质量值小于38)的读数，去除氮碱基以达到一定比例的读数(默认为10个碱基对)，以及删除与适配器重叠超过某个阈值(默认为15个碱基对)的读数．排序和预聚类步骤之后，对干净的序列进行分类，并以3%的序列差异将其聚类为可操作的分类单元．宏基因组测序分析可以了解主要微生物和功能基因，使用DIAMOND软件(V0.9.9)将单基因与古细菌的序列进行比较，这些序列都是从国家生物技术信息中心的非冗余蛋白质序列数据库中提取．同时，将单基因与KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)的功能数据库进行比较，分析代谢途径的变化和功能基因的表达．使用MEGAN软件进行系统分类，以确保物种注释信息正确[23]．1.3.4　其他测试方法红外光谱采用傅里叶变换红外光谱仪(德国，布鲁克公司，VERTEX 80/80vs)分析，堆肥样品冷冻干燥后与溴化钾按1:1的质量比例研磨后压片测试[24]．使用比表面积分析仪(北京，中国北京精微高博公司，BK112-TB)测试秸秆的比表面积及孔径．使用元素分析仪(德国，艾里蒙特公司，vario MACRO cube CHNS)测定样品中的碳、氮含量，将样品烘干后研磨至粉末状，过80目筛后进行测定．使用显微拉曼光谱仪(美国，赛默飞世尔公司，Thermo DXR)测定聚合物种类，光学放大倍数为100倍，扫描波长为785 nm．2 结果与讨论2.1　秸秆填充剂特性表征秸秆的基本特性如表4所示，四种秸秆的碳氮比在25~35之间，有机质含量均大于80%，玉米秸秆和小麦秸秆的比表面积较大，水稻秸秆和玉米秸秆的孔径较高．研究发现：由于秸秆具有中空结构，因此可以对材料进行支撑，增加初始混合物的孔隙体积，从而有利于氧气扩散和微生物群落的耗氧[25]．10.13245/j.hust.221012.T004表4秸秆基本特性秸秆质量分数/%含水率/%比表面积/(m2∙g-1)孔径/nmC有机质HNS玉米40.3690.615.421.590.27510.182.88814.238水稻35.9683.664.941.170.2519.452.36415.270油菜39.9293.115.481.690.7858.981.87313.832小麦39.9490.585.401.160.2529.253.23313.641根据初期研究表明：水稻秸秆表面相对平滑，并存在一些小空腔．油菜秸秆具有相对完整的内部结构，且表面具有一定条纹．小麦秸秆呈现光滑致密，高度有序、相邻和连接的纤维结构．整体来看，水稻秸秆、油菜秸秆和小麦秸秆具有比较规则且完整的形态，而玉米秸秆比较粗糙，内部孔数量较多，增加了外表面积和孔隙率，形成气体和液体渗透通道并增加与气体的接触面积，这可能对堆肥过程有利．文献[26]发现Fenton预处理改变了原料的结构，破坏了原料光滑的表面，提高了堆肥时木质纤维素的降解效率．2.2　利用秸秆堆肥处理餐厨垃圾过程中理化特性及蛋白类物质变化2.2.1　理化特性变化a. 堆肥过程中理化特性变化规律温度变化可以反映堆肥过程中的生物活性和过程动态，也影响着好氧堆肥的减量化、无害化和稳定化过程．温度变化如图1(a)所示，5组的堆肥温度曲线相似，经历了升温期、高温期、降温期三个阶段．在堆肥初始阶段，由于强烈的微生物活动，易降解有机物被降解，因此温度迅速升高，达到高温阶段．对照组最高温度为49 oC，未达到50 oC，不满足卫生处理要求．添加秸秆的试验组最高温度均高于54.5 oC，50 oC以上维持4~6 d，高温可以杀灭病原体和杂草种子，达到卫生处理要求．在高温阶段，有机物的生物降解程度最高，随着原料中有机物的消耗，温度逐渐下降，进入腐熟阶段．玉米秸秆组高温维持时间最久，峰值温度较高[27]．10.13245/j.hust.221012.F001图1堆肥过程理化性质变化在堆肥过程中，强烈的微生物活动和高温促进了某些多糖及含氮有机物等物质的水解，从而导致堆肥中有机质含量逐渐降低，一般而言，在堆肥的腐熟期，有机质含量下降到最低值，表明混合物在生物氧化阶段过后逐渐稳定[28]．堆肥过程有机质含量变化如图1(b)所示，当堆肥结束时，对照组、玉米秸秆组、水稻秸秆组、油菜秸秆组、小麦秸秆组有机质质量分数比堆肥初始阶段分别降低了0.06%，0.162%，0.142%，0.126%，0.159%．玉米秸秆组有机质降解幅度最大，比对照组提高了170%．有机物的高降解率与堆肥过程中较长的高温期和较高的温度有关，高温促进了嗜热微生物的生长，从而进一步降解纤维素和半纤维素等有机质，玉米秸秆组有机质降解最多可能是因为其高温期维持时间最久，微生物对有机质有着较高的利用效率．堆肥过程pH值变化如图1(c)所示，在最初的5天内，玉米秸秆组、水稻秸秆组、油菜秸秆组、小麦秸杆组pH值先上升后降低，最终分别稳定在8.51，8.59，8.33，8.34，对照组pH值一直呈现下降趋势最终逐渐稳定在6.07，pH值的稳定归因于腐殖质的缓冲能力[29]．堆体的高温和pH值及氨化细菌的活性会影响NH4+含量[30]．如图1(d)所示，5组NH4+含量呈现先上升后下降的趋势，在前三天内升高到最高值，有机氮的迅速矿化和氨化作用导致了NH4+含量升高[31]．随后由于微生物固定及温度升高，pH升高，因此大量NH4+挥发为NH3，NH4+的含量不断下降．堆肥结束时，除对照组外，其他四种秸秆处理的NH4+质量分数均在4×10-5以下，满足了堆肥的成熟性和稳定性要求，表明所得肥料满足安全要求，可用于农田应用[32]．高温对堆体物质有着良好的破解效果，使得微生物可以直接分解利用的可溶性蛋白质增多，在堆肥的高温阶段蛋白质含量升高[33]．随着堆肥进行，微生物消耗蛋白质作为氮源，蛋白质含量下降，这表明微生物更容易利用易降解分子．玉米秸秆组和小麦秸秆组的蛋白质含量在堆肥初期是先下降之后再上升，可能是因为微生物消耗的蛋白质抵消掉了高温破解堆体物质产生的蛋白质，使蛋白质含量暂时下降，这两组中微生物反应剧烈消耗大量蛋白质也导致了前4 d内温度高于另外3组．堆肥后期蛋白质含量逐渐稳定，当堆肥结束时，对照组、玉米秸秆组、水稻秸秆组、油菜秸秆组、小麦秸秆组蛋白质含量比初始分别降低了31.0%，59.8%，37.8%，43.2%，27.5%，玉米秸秆处理蛋白质降解率比对照组提高了92.9%，高于其他秸秆处理．种子发芽指数是评价堆肥成熟度的重要指标之一．初始几天的种子发芽指数较低，是由于氨的毒性作用及低分子量有机酸的存在，抑制植物生长[25]．有研究认为种子发芽指数超过85%表示堆肥已经成熟[34]，也有研究认为种子发芽指数约为90%的堆肥．应用于农地时，会对植物生长造成负面影响，适宜的种子发芽指数应大于100%~110%[25]．堆肥结束时，四种秸秆处理获得的堆肥的种子发芽指数均超过110%，表明植物毒性物质已经被减少或消除，该堆肥被认为是刺激植物生长的载体[35]，而对照组最终种子发芽指数仅为51%，该堆肥并未完全成熟．b. 堆体官能团结构变化图2是堆肥固相阶段的红外光谱．利用红外图谱法可以辨别化合物的特征官能团．不同堆肥阶段官能团组成相同，吸收峰强度上的差异仅表征官能团数量上的增减变化．10.13245/j.hust.221012.F002图2不同天数下的堆肥过程红外图谱演变堆肥样品红外光谱的特征峰中，3 700 cm-1处的较宽振动归因于O-H或N-H振动[29]．2 930 cm-1及2860 cm-1处的峰归因于脂肪族C-H伸缩振动[27]．1 650 cm-1处是芳香族结构，酰胺C-N、C=O的振动[36]．1 570~1 515 cm-1处是氨基化合物的N-H变形，C=N伸缩[29]．1 400~1 440 cm-1处是羧酸分子中的—OH面内弯曲振动、羧酸盐的C=O伸缩振动[3]，堆肥中的有机物质在氧气存在情况下转化为羧基碳，然后以CO2形式释放，导致羧基碳含量波动．1 070 cm-1处是多糖的C—O键伸缩振动[37]，由于多糖类物质的降解，因此除对照组外的四个秸秆组此处特征峰强度降低[27]．4个秸秆组堆肥前8 d，2 930 cm-1及2 860 cm-1处特征峰强度降低，1 650 cm-1处特征峰强度升高，表明脂肪碳含量降低，芳香碳含量升高．之后2 930 cm-1及2 860 cm-1处特征峰强度逐渐升高，1 650 cm-1处特征峰强度降低，说明随着堆肥的进行，芳香结构化程度降低，可能是因为堆肥后期利用较难分解的有机质维持堆体内微生物的活动，造成堆肥后期芳香族物质的减少，芳香性降低．该结果与文献[38]的研究结果一致，在堆肥过程中，主要有机成分(木质素、纤维素、半纤维素和蛋白质)降解，导致大量简单有机化合物释放，例如碳水化合物、氨基酸、结构复杂程度低的酚类，这些物质可以被微生物降解，作为碳源及能量来源，也可以被微生物用来合成新的腐殖酸类物质．随着堆肥过程的进行，1 650 cm-1/1 400 cm-1(芳香碳/羧基碳)处峰值比值降低，表明中间产物(酮、醛)还原．秸秆处理1 650 cm-1/1 070 cm-1(芳香碳/多糖碳)处峰值比值增加，表明多糖降解和腐殖质芳香结构形成，堆肥逐渐稳定化，对照组该峰值比值降低，堆肥未完全成熟．2.2.2　游离氨基酸变化本试验检测了堆肥过程几种游离氨基酸含量，当堆肥中微生物死亡时，它们中所含的氮首先被水解成氨基酸，因此通过蛋白质的水解会产生大量氨基酸，具有不同功能成分的氨基酸的变化很可能受到微生物对蛋白质的降解和合成的影响[39]．堆肥过程游离氨基酸的变化如表5和表6所示，堆体中脯氨酸(Proline，简称Pro)含量逐渐增加，在第35 d时，对照组、玉米秸秆组、水稻秸秆组、油菜秸秆组、小麦秸秆组脯氨酸质量摩尔浓度分别为70.4，129.7，110.7，146.9，109.0 mmol/kg．10.13245/j.hust.221012.T005表5脯氨酸质量摩尔浓度变化天数/d对照组玉米秸秆水稻秸秆油菜秸秆小麦秸秆11.633.15.711.27.6820.327.724.051.447.61785.470.329.5165.590.73570.4129.7110.7146.9109.0mmol/kg10.13245/j.hust.221012.T006表6堆肥过程游离氨基酸变化试验分组游离氨基酸天数/d181735对照组Asp0.02.12.99.1Glu0.00.00.01.8His4.43.08.111.1Cys0.00.02.70.0Tyr，Met，Phe，Ile1.98.520.212.9玉米秸秆Asp2.67.216.017.5Glu1.110.718.219.0His3.73.86.09.5Cys9.722.929.632.2Tyr，Met，Phe，Ile2.15.317.631.0水稻秸秆Asp3.86.817.017.1Glu0.013.117.818.6His2.53.73.24.6Cys8.233.320.137.7Tyr，Met，Phe，Ile4.96.526.032.9油菜秸秆Asp0.50.38.112.6Glu0.010.48.711.6His0.01.33.56.0Cys10.39.020.731.9Tyr，Met，Phe，Ile2.35.814.324.5小麦秸秆Asp4.62.915.215.0Glu2.312.714.817.4His0.64.35.310.3Cys8.719.625.827.7Tyr，Met，Phe，Ile2.86.516.626.7mmol/kg天冬氨酸(Aspartic，简称Asp)和谷氨酸(Glutamic，简称Glu)质量摩尔浓度在整个过程中有所波动，整体呈现增加趋势．Asp和Glu是促进生长的氨基酸，是成熟堆肥中的重要副产物，对植物的生长过程有益，在种子和花粉萌发、生长素合成、叶片光合作用和叶绿素生成等方面发挥积极作用[39]．堆肥中的一些具有含氮结构的氨基酸，可以螯合土壤中的重金属，阻碍重金属在植物中的转运，因此在促进植物生长和发育中起着重要作用，例如组氨酸(Histidine，简称His)和半胱氨酸(Cysteine，简称Cys)，它们是植物生长过程中的天然重金属螯合剂[39]．在本试验中，当堆肥结束时，对照组、玉米秸秆组、水稻秸秆组、油菜秸秆组、小麦秸秆组His质量摩尔浓度分别增加至11.1，9.5，4.6，6.0，10.3 mmol/kg，Cys质量摩尔浓度增加至0.0，32.2，37.7，31.9，27.7 mmol/kg．半胱氨酸是抗氧化防御和金属螯合的主要代谢产物，如研究发现转基因拟南芥菌株具有增强的金属诱导的半胱氨酸合成能力，以应对急性Cd胁迫[40]．这些游离氨基酸含量的增加提高了堆肥质量．成熟堆肥中有一些氨基酸能被黏土矿物、倍半氧化物和土壤有机质吸收，降低了它们对养分溶解度的影响，对调节作物生长、提高作物产量和品质具有积极作用，酪氨酸(Tyrosine，简称Tyr)、甲硫氨酸(Methionine，简称Met)、苯丙氨酸(Phenylalanine，简称Phe)、异亮氨酸(Isoleucine，简称Ile)属于此种耐盐氨基酸．2.2.3　利用秸秆堆肥处理餐厨垃圾过程中蛋白类物质变化规律为了定量评估堆肥过程中溶解性有机质的分布比例和荧光强度的演变，将各个区域荧光强度进行区域体积积分，Ⅰ +Ⅱ区(蛋白类物质)、Ⅲ区(富里酸类物质)、Ⅳ区(可溶性微生物副产物)和Ⅴ区(腐殖酸类物质)所占百分比分别记为P(i，n)(为Ⅰ+Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ)，如表7所示．10.13245/j.hust.221012.T007表7堆肥过程荧光响应百分比变化试验分组区域天数/d135812172535对照组Ⅰ，Ⅱ区0.020.030.030.030.020.020.010.01Ⅲ区0.090.070.080.070.080.090.070.07IV区0.100.090.090.090.080.070.060.06V区0.790.810.800.820.820.820.860.86玉米秸秆Ⅰ，Ⅱ区0.140.110.020.000.000.000.010.01Ⅲ区0.110.120.050.030.030.040.060.05IV区0.330.250.060.020.020.020.030.02V区0.410.520.870.950.950.940.910.92水稻秸秆Ⅰ，Ⅱ区0.100.040.010.010.000.010.010.01Ⅲ区0.260.080.040.030.030.030.050.04IV区0.200.140.060.030.020.020.020.02V区0.440.740.890.940.950.940.920.94油菜秸秆Ⅰ，Ⅱ区0.150.060.020.010.010.010.020.01Ⅲ区0.160.080.050.050.080.090.100.07IV区0.330.170.080.040.050.050.050.04V区0.360.690.840.890.850.840.830.88小麦秸秆Ⅰ，Ⅱ区0.140.060.010.000.000.000.010.00Ⅲ区0.150.080.030.020.030.040.050.03IV区0.300.160.050.020.020.020.030.02V区0.420.690.900.960.960.940.920.95%在堆肥过程前8 d，4个秸秆组的类蛋白物质和可溶性微生物副产物含量逐渐降低，反映了高温期不稳定有机质由于微生物活动逐渐降解[20]，这也促使堆体中温度逐渐升高．从第5 d开始，腐殖质酸类物质含量有所增加，直至堆肥结束，表明腐殖化程度逐渐增强[41]，腐殖质酸类物质通常具有更高的化学稳定性，增加了有机物在环境中的停留时间，因此改善了土壤结构和肥力[3]．对照组中几种物质的含量无明显变化．对照组、玉米秸秆组、水稻秸秆组、油菜秸秆组和小麦秸秆组的P(Ⅰ+Ⅱ，n)在堆肥第35 d时比堆肥第1 d分别降低了39.6%，95.8%，94.6%，93.1%，96.8%，芳香族蛋白质在堆肥过程中不断降解．堆肥第35 d，P(Ⅳ，n)下降到5.6%，2.4%，1.9%，3.9%，1.7%，P(V，n)增加至86.0%，92.4%，93.9%，88.1%，95.1%．对照组的芳香族蛋白质和可溶性微生物副产物降解比例，以及腐殖质酸类物质的增加比例远低于秸秆处理．在堆肥过程中，P(Ⅳ，n)的变化趋势与芳香族蛋白物质的变化趋势一致，均随着时间的延长而降低．说明在堆肥的过程中微生物残体及微生物代谢产物也发生了结构变化，可能也转化为腐殖质酸类物质[42]，腐殖酸类物质成为最终堆肥的主要成分．从生物降解的角度来看，蛋白质和微生物副产物物质是易于降解的物质，而腐殖酸类物质的物质则不易被微生物降解[41]．第3 d后，Ⅲ区的P(Ⅲ，n)开始下降，表明富里酸类物质很容易分解．2.3　利用秸秆堆肥处理餐厨垃圾过程中微生物群落变化特征2.3.1　细菌群落结构组成表8为门水平上细菌相对丰度的变化，表中：X1为其他；X2为Saccharibacteria；X3为Deinococcus-Thermus；X4为Gemmatimonadetes；X5为Chloroflexi；X6为Bacteroidetes；X7为Proteobacteria；X8为Actinobacteria；X9为Firmicutes．与已有研究结果类似，厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)是堆肥过程的优势菌群[43]．10.13245/j.hust.221012.T008表8细菌门水平相对丰度变化试验分组天数/d细菌门编号X1X2X3X4X5X6X7X8X9对照组10.430.000.000.000.000.070.1444.654.7680.480.000.000.000.000.000.0934.7964.63350.010.000.000.000.000.010.2020.6279.17玉米秸秆10.020.030.000.000.000.022.5647.4249.9380.030.000.000.000.000.013.8532.9663.15350.100.050.252.727.7313.5615.4523.0937.05水稻秸秆10.040.000.010.000.000.015.3131.2463.4080.010.000.000.060.540.040.8335.6762.85350.220.170.653.137.5515.1223.9425.9123.33油菜秸秆10.000.010.000.000.000.023.0546.2350.6980.070.000.020.090.430.041.4341.1756.74350.631.022.374.7112.7216.3221.2321.9619.04小麦秸秆10.000.000.000.000.000.001.4149.4649.1180.130.000.010.050.110.001.8041.9655.95350.210.230.271.889.7831.2724.4922.199.68%Firmicutes在堆肥初期是优势菌门，此时糖和其他易分解的物质在分解和发酵过程中被优先消耗，而Firmicutes可以有效降解碳水化合物[43]．高温期时4个秸秆组其相对丰度达到了堆肥进程中的最高值，其中玉米秸秆组Firmicutes相对丰度最高为63.15%，结果与玉米秸秆组有机质具有最大降解率一致．文献[44]发现：Firmicutes在堆肥中纤维素的分解和利用中占据主导地位，Firmicutes相对丰度较高时，有机物分解达到顶峰．当堆肥进入腐熟期时，秸秆处理中Firmicutes的相对丰度显著下降．Firmicutes是可生成芽孢的细菌，这可能是它在初始底物中占据优势地位的原因，其耐高温能力使其在高温阶段仍然活跃并存活[45]．Actinobacteria是一种具有耐热耐碱属性的可降解木质纤维素的革兰氏阳性菌，可以通过释放抗生素杀死或和抑制各种病原微生物，在堆肥腐熟阶段随着堆体内木质素和纤维素含量的减少而下降[46]．Proteobacteria是腐熟阶段另一优势菌种，是降解葡萄糖、丙酸盐、丁酸盐等能量代谢相关小分子的关键细菌[47]．Bacteroidetes是耐热菌，可以在高温阶段生存，但是随着堆肥进行温度下降，Bacteroidetes相对丰度显著增加，Bacteroidetes在利用多糖和释放短链脂肪酸方面发挥作用，堆肥冷却腐熟阶段微生物主要利用木质素和木聚糖作为碳源，因此Bacteroidetes相对丰度增加[45-46]．对照组整个堆肥过程中优势菌群都为Firmicutes和Actinobacteria，微生物多样性较低．在堆肥过程中属水平细菌的相对丰度的变化如表9所示，表中：B1为其他；B2为Cellvibrio；B3为Saccharomonospora；B4为Sinibacillus；B5为Lactobacillus；B6为Facklamia；B7为Jeotgalicoccus；B8为Bacillus；B9为Oceanobacillus；B10为Corynebacterium_1；B11为norank_o__JG30-KF-CM45．19个细菌属分布在5个细菌门上，包括厚壁菌门(Firmicutes)12个属，放线菌门(Actinobacteria)4个属，变形菌门(Proteobacteria)1个属，拟杆菌门(Bacteroidetes)1个属，绿弯菌门(Chloroflexi)1个属．其中有一个细菌属属于分类学数据库分类学谱系的中间等级，没有科学名称，以norank作为标记，分属绿弯菌门(Chloroflexi)[48]．10.13245/j.hust.221012.T009表9细菌属水平相对丰度变化试验分组天数/d细菌属编号B1B2B3B4B5B6B7B8B9B10B11对照组152.630.000.000.001.280.003.956.470.000.0035.68862.920.000.000.002.500.001.471.030.041.6430.383549.740.000.000.090.630.000.140.132.8727.0819.32玉米秸秆130.270.000.000.001.290.0013.3814.200.020.0240.81840.270.000.000.004.570.0011.1416.190.010.0127.823557.904.641.822.260.027.500.010.0515.879.450.48水稻秸秆144.640.000.000.003.740.0013.1914.080.010.0224.31837.460.000.476.821.490.540.031.0919.7010.9021.513567.789.621.581.330.016.870.020.108.623.630.45油菜秸秆139.400.010.070.015.280.009.2510.090.040.0235.83834.370.001.265.500.300.420.071.2712.6517.3126.843573.501.061.401.330.0210.940.020.107.943.430.27小麦秸秆130.290.000.000.004.450.008.6313.180.000.0143.44830.230.0010.867.310.360.110.401.0913.5412.7623.353568.048.737.160.510.009.290.000.033.961.950.33%在堆肥初始阶段，相对丰度较高的有棒杆菌属(Corynebacterium-1)，Jeotgalicoccus，Facklamia，乳酸杆菌(Lactobacillus)．Corynebacterium-1在整个堆肥过程中相对丰度逐渐降低，是导致放线菌门数量变化的主要原因，堆肥初期玉米秸秆组、水稻秸秆组、油菜秸秆组、小麦秸秆组中的相对丰度分别为40.81%，24.31%，35.83%，43.44%，腐熟期其相对丰度不足1%，下降比例达99.9%，研究表明Corynebacterium-1是潜在的人类致病菌，堆肥可以影响放线菌门的关键细菌属从而影响抗生素的分布，有效降低致病菌带来的环境风险[49]，而对照组堆肥初期Corynebacterium-1相对丰度为35.68%，腐熟期相对丰度为19.32%，下降比例显著低于秸秆处理，不能降低环境风险．Lactobacillus是一种厌氧细菌，通常参与厌氧发酵，可产生大量有机酸，导致堆肥的pH值迅速降低，随着堆肥进行堆体内曝气条件良好，Lactobacillus逐渐消失[50]．高温阶段，相对丰度较高的有Corynebacterium-1，Bacillus，Sinibacillus，Oceanobacillus．芽孢杆菌(Bacillus)对高温环境具有较强抗逆性，在高温期广泛存在，而且Bacillus可以分解复杂有机物如果胶、纤维素等，具有产生羧甲基纤维素的能力，羧甲基纤维素是一种参与多糖和木质纤维素化合物降解的酶[44， 47]．Sinibacillus耐高温，有助于增加堆肥过程中的电导率，容易吸收有机质，通常与碳氮比呈正相关，高温期过后，温度下降导致Sinibacillus相对丰度降低[47]．腐熟阶段，相对丰度较高的有Bacillus、纤维弧菌(Cellvibrio)，与文献[51]的研究类似，与木质纤维素降解相关的温双岐菌属(Thermobifida)在腐熟阶段富集．Cellvibrio是一种具有降解纤维素能力的嗜温性细菌，而且具备降解多糖的能力，是一种重要的环境适应菌，在堆肥初期和高温期不存在，腐熟期秸秆处理中其相对丰度增加[52]．嗜温性细菌糖单胞菌(Saccharomonospora)能抵抗高温降解木质素和纤维素将其转化为稳定的腐殖质，而且可以产生多种抗生素，降低堆肥有机肥的毒性，堆肥腐熟阶段的主要的底物是纤维素和木质素，因此第35 d时4个秸秆组Saccharomonospora相对丰度均增加[50]．当堆肥过程结束时，4个秸秆组存在具有分解纤维素等难溶性有机质的能力的菌属，细菌群落结构的进化可以解释为堆肥的微生物种群对木质纤维素生物质的独特适应已经出现[52]．对照组腐熟期不存在Cellvibrio和Saccharomonospora，这也导致其有机质降解率低于4个秸秆组．综合细菌群落在属水平上的演替，表明添加秸秆试验组可以增加物种丰度，改善堆肥的生境状态；同时，随着蛋白质和氨基酸的降解，相关优势的功能细菌相对丰度增加，进一步富集，表现出优异的降解效果，从而提高堆肥的质量．2.3.2　相关性分析相关性Heatmap图通过相关性数值可视化展示样本中不同物种与环境变量之间的相关性，物种与环境因子的相关性分析见图3，相关性系数p0.05．10.13245/j.hust.221012.F003图3属水平上理化性质与细菌群落的热图相关分析Georgenia，Thermobifida，Bacillus三种细菌与OM负相关，说明这三种细菌在有机质降解中发挥作用．Saccharomonospora能够将酚类化合物水解为无毒形式，与OM负相关，说明有机质可能影响放线菌门中的Saccharomonospora的解毒作用．Jeotgalicoccus与NH4+正相关，Jeotgalicoccus的相对丰度在初始阶段最高，高温期大量下降，与堆体中含量NH4+的变化基本一致．Luteivirga和Thermobifida与蛋白质负相关，说明此细菌属在蛋白质利用中发挥作用，腐熟期两种细菌属相对含量升高．种子发芽指数是与堆肥过程中堆肥成熟度和植物毒性密切相关的重要生物学指标，先前的研究表明放线菌门可抑制各种病原微生物，减少植物毒性[53]，在本试验中也发现放线菌门中的细菌属Thermobifida与种子发芽指数正相关．Corynebacterium-1，Facklamia与种子发芽指数负相关，堆肥初始阶段这两种细菌属大量存在，在腐熟期消失不见，而腐熟期时4个处理的种子发芽指数值显著增加．2.3.3　微生物的代谢功能分析图4显示了KEGG3级代谢功能类别变化．表10显示了PICRUSt基于KEGG(京都基因与基因组百科全书)通路预测微生物的代谢功能，明确堆肥不同阶段细菌群落的功能变化．根据所有堆肥样品中序列的相对丰度，在l水平主要途径为：代谢(77.0%~78.4%，11种通路)、遗传信息处理(7.2%~7.9%，4种通路)、环境信息处理(5.6%~6.5%，3种通路)、细胞过程(3.8%~4.2%，3种通路)，在这些途径中，代谢序列最丰富，与堆肥过程中有机物的分解相关[44]．10.13245/j.hust.221012.F004图4KEGG3级代谢功能类别变化(色标单位：%)10.13245/j.hust.221012.T010表10微生物的代谢功能谱变化代谢功能第1 d第35 d对照组玉米水稻油菜小麦对照组玉米水稻油菜小麦代谢氨基酸代谢8.067.547.287.497.538.068.218.058.098.28其他次生代谢物生物合成1.241.141.091.151.151.231.461.531.541.62碳水化合物代谢9.989.909.8910.009.9210.319.389.209.148.91能量代谢3.904.034.043.973.963.804.224.284.374.29聚糖的生物合成与代谢1.071.211.211.231.251.031.111.201.161.35脂质代谢2.162.092.142.142.072.342.402.292.272.32辅因子和维生素代谢4.234.144.074.074.203.894.224.284.284.29其他氨基酸代谢1.491.531.561.551.551.471.551.561.561.56萜类和多酮类代谢1.051.031.001.071.061.061.131.131.121.25核苷酸代谢2.712.953.032.993.012.632.432.432.452.39外源生物降解与代谢1.431.561.531.651.531.291.601.591.621.75遗传信息处理折叠、分类和降解1.481.561.601.541.561.411.411.421.441.40复制和修复2.853.223.283.233.282.642.562.582.652.57转录0.190.220.220.210.220.170.150.150.150.13翻译3.143.623.763.593.622.872.782.812.892.81环境信息处理膜转运3.373.803.983.713.603.633.043.052.952.63信号传导2.702.242.342.242.243.042.722.652.472.39信号分子及相互作用0.000.000.000.000.000.000.000.000.000.00细胞过程细胞生长和死亡0.660.690.690.690.690.620.700.740.760.78细胞运动0.870.170.310.190.141.351.131.070.960.76运输和分解代谢0.330.270.240.280.270.360.360.350.330.38%在水平2，碳水化合物代谢和氨基酸代谢是两个主要的代谢途径．碳水化合物代谢序列在堆肥初始阶段丰度最高，在秸秆堆肥过程中，碳水化合物代谢在降解半纤维素和纤维素中起着至关重要的作用[53]．氨基酸是细菌代谢的能源和碳源，可产生于堆肥过程，在这项研究中，与氨基酸代谢相关的序列的相对丰度在堆肥腐熟阶段最高，与初始堆肥相比，对照组、玉米秸秆组、水稻秸秆组、油菜秸秆组、小麦秸秆组其相对丰度分别增加了0.2%，8.9%，10.7%，8.0%，9.9%，腐熟期玉米秸秆组氨基酸代谢的相对丰度高于另外4组，氨基酸代谢的序列越多，氨基酸产生和腐殖酸类物质合成的促进作用就越明显[44]．图4显示：在堆肥过程中，与赖氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、脯氨酸和组氨酸代谢相关的序列增加．与对照组相比，秸秆处理增加了堆肥中能量代谢的丰度，包括氮代谢、氧化磷酸化及碳固定通路．因为有氧代谢增强，所以除对照组之外，4个秸秆组的甲烷代谢序列降低，说明秸秆作为填充剂可增加通风供氧[54]．与初始阶段相比，与糖酵解和糖质新生相关的序列在腐熟期逐渐降低，玉米秸秆组、水稻秸秆组、油菜秸秆组、小麦秸秆组中其相对丰度分别降低了11.9%，15.7%，15.1%，20.6%，对照组糖酵解和糖质新生序列相对丰度增加了1.6%．易于降解的底物在堆肥前期快速消耗，腐熟期涉及半乳糖、磷酸戊糖、果糖、甘露糖、淀粉、蔗糖、氨基糖、核苷酸糖、甘油脂类和甘油磷脂代谢途径的基因序列的相对丰度逐渐降低．相反，随着堆肥过程的进行，乙醛酸、二羧酸、丁酸代谢和、柠檬酸循环涉及的基因丰度增加，其代谢功能的变化与已有研究一致[51]．在堆肥第35 d，与脂肪酸，不饱和脂肪酸，酮体和聚糖的生物合成有关的基因丰富，说明缩聚类腐殖酸类物质在腐熟期形成[54]．3 结论a. 对比未添加秸秆组，添加了玉米、水稻、油菜、小麦后的试验组中最终NH4+质量分数均在4×10-5以下，种子发芽指数值大于110%，满足堆肥成熟要求．相比之下，未添加秸秆对照组最高温度未达到50 oC，最终NH4+质量分数为1.91×10-5，最终种子发芽指数值为51%，不满足堆肥腐熟要求．玉米秸秆组高温期最久，峰值温度较高，有机质和蛋白质降解率分别比对照组提高170.0%和92.9%，高于其他秸秆处理．堆肥过程光谱和结构表征的结果显示：秸秆作为填充剂可以改善堆肥过程，提高堆肥腐殖化程度和稳定度；同时，玉米秸秆是较优的填充剂．b. 与堆肥初期相比，对照组、玉米、水稻、油菜、小麦秸秆组腐熟期氨基酸代谢序列的相对丰度分别增加了0.2%，8.9%，10.7%，8.0%，9.9%；同时检测了游离氨基酸浓度的变化，其中脯氨酸浓度最高，腐熟期时对照组，玉米、水稻、油菜、小麦秸秆其浓度分别增加至70.35，129.69，110.66，146.87和108.96 mmol/kg．此外，堆肥中还检测出其他多种游离氨基酸，包括促进生长的氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)，耐盐氨基酸(酪氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸)，天然重金属螯合剂(组氨酸、半胱氨酸)，在堆肥进程中，其浓度增加．氨基酸浓度的增加提高了堆肥质量．c. 厚壁菌门(Firmicutes，38%~49%)、放线菌门(Actinobacteria，31%~38%)、变形菌门(Proteobacteria，7.9%~11.0%)和拟杆菌门(Bacteroidetes，5.3%~11.0%)是秸秆处理的优势菌门，其存在推动了堆肥中氨基酸产生和腐殖酸类物质合成的促进作用．当堆肥过程结束时，4个秸秆组存在纤维弧菌(Cellvibrio)和糖单孢菌(Saccharomonospora)等具有分解纤维素等难溶性有机质能力的菌属．棒杆菌属 (Corynebacterium-1)是潜在的人类致病菌，秸秆处理中Corynebacterium-1相对丰度下降比例达99.9%，对照组其下降比例仅为16.3%．与对照组相比，秸秆作为填充剂不仅可以促使蛋白质的降解，还能降低致病菌带来的环境风险，增加细菌种类，对堆肥过程有利．