自然界中，重金属广泛分布于土壤和水体中，自然本底的重金属通常不会达到对人体有害的程度[1]．随着工业的发展，重金属被大量开采、冶炼和应用，已成为严重的环境污染物．污水直接排放、露天采矿活动、化石燃料的大量燃烧和城市垃圾的不当处理，均能导致水体和土壤中重金属浓度急剧上升[2]．过量的重金属摄入往往对人体健康有极大的危害，例如：过量的Cu2+会导致线粒体脂质过氧化、肝损伤与肝硬化，Cu2+严重过量时甚至会产生神经系统功能性改变，导致阿尔茨海默症、动脉粥样硬化与癌症[3]；急性镉中毒会导致腹泻和呕吐，长期接触Cd2+则会导致肾损伤和骨损伤，还会影响生育并致癌[4]；过量的Ni2+除造成肝、肾、生殖器官毒性外，还会毒害心、肺、血液和免疫器官[5]；过量的Zn2+会引起动物的厌食和呕吐，进一步发展为腹泻、昏睡、黄疸、休克、血管内溶血、血红蛋白尿、心律失常和抽搐[6]；而Pb2+对人体绝大多数器官都有伤害，如造成消化不良和内分泌失调，尤其对儿童脑部和骨骼的发育有较大影响，还会造成贫血[7]、记忆衰退[8]，破坏肾功能[9]和免疫功能[10]，带来不可逆转的严重后果[11]．化学沉淀法和离子交换法是目前处理重金属污染废水的常用方法．化学沉淀法主要是通过絮凝剂使重金属离子形成沉淀，从而达到一定的处理效果，但对游离态金属处理难度大，且使用化学沉淀法会产生难以处理的重金属污泥[12]．离子交换法是指使用具有特殊官能团的离子交换树脂，将污水中的有害重金属离子交换吸附在树脂上，并加以去除，具有离子交换树脂处理容量有限、回收后性能下降及处理的金属离子较为单一等缺点，制约了其推广与应用[13]．为此，亟须探索更加环保高效的重金属污染处理新技术、新方法．微生物诱导碳酸盐沉淀(microbially induced carbonate precipitation，MICP)是近年来被提出的一种处理重金属污染废水的方法[14-15]．MICP的工作原理为：微生物分解尿素产生CO32-，并在金属离子存在的条件下生成金属碳酸盐沉淀，从而把溶解态的金属离子以碳酸盐沉淀的形式固定[16]，同时带有负电荷的细胞表面基团及细胞外聚合物(EPS)也可以结合金属阳离子，为碳酸盐的沉积提供理想的成核位点和生长模版[17]，从而除去水中金属阳离子[18]．与传统的化学沉淀法相比，使用MICP方法无须添加大剂量的沉淀剂，更加绿色环保，且对低浓度重金属处理效果较好．野生型巴氏芽孢八叠球菌(Sporosarcina pasteurii，SP)是高效表达脲酶的菌株，在MICP过程中，该菌通过表达脲酶催化尿素水解，从而迅速提高细胞微环境的 pH值与碳酸根浓度，形成诱导碳酸钙沉淀所需要的碱性环境．为了比较自然菌株和脲酶工程菌株的矿化效果和MICP的适用条件，并对其进行优化和提升，本试验以实验室构建的脲酶工程菌(urease engineering bacteria，UE)和野生型菌巴氏芽孢八叠球菌(SP)作为试验对象，利用它们诱导MICP处理多种重金属离子的模拟废水，考察其对沉淀多种重金属的效率及偏好性，本研究结果表明：以脲酶工程菌(UE)和野生型菌巴氏芽孢八叠球菌(SP)诱导的MICP技术可以有效沉淀溶液中的重金属离子(Cu2+，Ni2+和Cd2+)，为人工治理重金属污染、新型生物材料的发展提供了新思路．1 材料与方法1.1　菌液的制备本研究中所用工程菌为在宿主枯草芽孢杆菌中表达脲酶基因的菌株，该菌株只能加快尿素结合水变成氨基甲酸、进而氨基甲酸结合水分解为碳酸和氨的反应速度；不会加快氨变成氨水并促进重金属离子变成碳酸盐沉淀的过程[19]．本研究将对照菌巴氏芽孢八叠球菌单独为一组(SP)、脲酶工程菌单独为一组(UE)、两种菌含量1∶1混合为一组(SP+UE)，通过比较一定时间内的重金属离子沉淀效率以考察工程菌和对照菌去除重金属离子的效果．本研究使用的巴氏芽孢八叠球菌取自实验室冻存的菌种(DSM 33，ATCC11859 和NCIB 8841)，活化后以铵盐-酵母提取物培养基(ATCC 1376)扩培；实验室冻存的脲酶工程菌活化后以含氯霉素的LB (Luria-Bertani)液体培养基扩培．本研究通过测量电导率的变化来测定脲酶活性[20]．测量方法为：取菌液13.5 mL和浓度为8 mol/L的尿素1.5 mL混合在一起，使用电导率仪监测溶液5 min内电导率的变化，所测5 min内平均电导率变化值乘以稀释倍数(1.11倍)，即为菌液酶活性，菌液脲酶酶活可直观地反映菌液水解尿素的能力[21]．测得巴氏芽孢八叠球菌的酶活为312.2 mmol/(L∙min)，脲酶工程菌的酶活为593.3 mmol/(L∙ min)．本研究使用紫外分光光度计测量菌液的浓度，测得野生型菌和脲酶工程菌在600 nm处的吸光度(OD600)分别为3.990和3.890．1.2　配置模拟废水选用生活中最常见的几种重金属离子[22]配置模拟废水，所用化合物均为分析纯CuSO4∙5H2O，CdCl2，NiSO4∙6H2O及ZnSO4∙7H2O．模拟废水中主要的重金属离子的质量浓度：Cd2+为8.7 mg/L，Cu2+为1 264 mg/L，Ni2+为105 mg/L，Zn2+为1 589 mg/L[23]．通过测试处理前后模拟重金属污染水体中各重金属的浓度变化，计算工程菌和对照菌的处理效率，比较两种细菌的处理效果；并对处理得到的固体产物进行物相分析表征，探讨生物矿化处理重金属污染的相关机理．1.3　试验设置模拟废水中：Cu2+质量浓度为1 264 mg/L；Cd2+质量浓度为8.7 mg/L；Ni2+质量浓度为105 mg/L；Zn2+质量浓度为1 589 mg/L，将菌液与模拟废水以表1所示的方式混合，每组设置3个平行试验，定时取样测定金属离子的质量浓度，并分别计算处理金属离子的效率，比较重金属的去除率．混合体系为60 mL，包含20 mL菌液、30 mL模拟废水溶液及10 mL 8 mol/L的尿素(碳源)，混合体系置于37 ℃、转速为200 r/min的恒温摇床中培养．培养开始后0.5，1.0，2.0 h各取一次样，2~24 h每隔2 h取一次样，24 h后于48 h及72 h处取样，每次取样2 mL用于测定重金属离子质量浓度．另置体系60 mL的混合重金属处理液(四种重金属原液体积比为1∶1∶1∶1共30 mL，10 mL尿素和20 mL菌液)，取样但不用于重金属含量测试，只在离心烘干后通过扫描电子显微镜(SEM)观察和酸解实验．10.13245/j.hust.230419.T001表1菌液与模拟废水的混合配比菌种CuCdNiZnSPSP+CuSP+CdSP+NiSP+ZnUEUE+CuUE+CdUE+NiUE+ZnSP+UESP+UE+CuSP+UE+CdSP+UE+NiSP+UE+Zn1.4　分析测试方法72 h的反应完成后，将得到的沉淀离心烘干后进行物相表征分析，通过SEM观察晶体的聚集状态、成型方式、菌孔等，并通过酸处理确定生成的沉淀是否为碳酸盐．1.4.1　重金属离子的测定试验使用原子吸收分光光度计来测定金属离子质量浓度．向1 mL反应完成的样品混合液中加入0.5 mL浓度为6 mol/L的硝酸煮沸20 min以硝化去除样品中的有机物．以0.22 μm滤膜过滤去除样品溶液中的其他杂质．根据原子吸收光谱对各种金属离子测定的质量浓度要求(Cd2+为0~2 mg/L，Cu2+为0~5 mg/L，Ni2+为0~5 mg/L，Zn2+为0.0~0.5 mg/L)，对样品进行稀释，经计算得出：Cu应稀释100倍；Ni应稀释20倍；Cd应稀释10倍；Zn应稀释1 000倍．对硝化去有机质、过滤除杂质、稀释之后的样品采用原子吸收光谱法测定重金属离子质量浓度．1.4.2　观察金属碳酸盐晶体状态最后一次取样后，剩下的样品放入离心机中6 000 r/min离心5 min，离心完成后，将上清液全倒掉，放入65 ℃烘箱中烘干．筛选出符合SEM制样要求的样本，为增强样本导电性，对样品喷金5 min．观察SEM下金属碳酸盐晶体的晶体形态、成型方式、聚集态等．1.4.3　酸处理计算沉淀的最大可能质量并分别向其中加入略微过量的硝酸，观察加入硝酸后是否有气泡产生，取溶解Cu2+，Cd2+，Ni2+的酸液各100 μL，Zn2+酸液10 μL分别加入去离子水配置成10 mL体系，并用原子吸收分光光度计测量其中的离子浓度．2 实验结果2.1　利用MICP技术沉淀多种重金属离子的效率比较图1为利用MICP技术去除多种重金属离子的效率比较．10.13245/j.hust.230419.F001图1利用MICP技术去除多种重金属离子的效率比较2.1.1　铜离子的去除率对照组和试验组中Cu2+去除率如图1(a)所示，经MICP技术处理后三组中Cu2+去除率均达到70%以上，试验组(UE，SP+UE)和对照组(SP)对Cu2+的去除效率差别不明显，分别为72.16%，71.62%和72.34%．试验结果显示：初始反应速率较快，在0.5 h处理后，各组去除率分别可达66.41%，65.00%和66.67%，原因为菌液本身含有一定量的碳酸根离子，反应初始迅速产生碳酸铜沉淀，随着反应进行，菌株产生更多碳酸根沉淀铜离子，从而提升去除率．由此可见：MICP技术可以有效促进铜离子的沉淀，且去除速率较快．2.1.2　镉离子的去除率对照组和试验组中Cd2+的去除率如图1(b)所示，反应24 h后Cd2+在不同溶液中的去除率表现出一定差异，对照组(SP)对镉离子的去除率随反应进行上升速率较慢，且最终去除率明显低于试验组，原因为SP细菌产生的脲酶量较低，导致碳酸根产量较低，不能高效沉淀Cd2+；单一脲酶工程菌组(UE)前期对Cd2+去除率上升较快，主要原因为脲酶工程菌中脲酶活力较高，高效产生的碳酸根离子有助于Cd2+的快速沉淀，而24 h之后去除速率变慢，部分原因为脲酶活力受重金属抑制作用，导致酶活力下降；混合菌组(SP+UE)对镉离子去除率随反应进行持续上升．72 h后SP，UE，SP+UE细菌组对Cd2+最终去除率分别为85.62%，93.83%和95.05%，可见脲酶工程菌的加入对利用MICP技术去除镉离子有明显的助力作用．2.1.3　镍离子的去除率对照组和试验组中Ni2+去除率如图1(c)所示，在反应前15 h，三个菌组(SP，UE，SP+UE)对Ni2+ 的去除率均快速上升，最终分别达到98.65%，90.44%和98.41%，各组对Ni2+去除效率均接近饱和且差别不明显，文献报道镍离子对脲酶有激活作用[24]，可促进脲酶催化尿素生成碳酸根离子，因此本研究中的三个细菌组对Ni2+的去除率明显高于其他重金属离子，说明MICP技术在去除镍离子的应用中有很好效果．2.1.4　锌离子的去除率对照组和试验组中Zn2+的去除率如图1(d)所示，与Cu2+，Cd2+和Ni2+相比，3个细菌组对锌离子的去除率均较低，仅约为40%(SP，UE，SP+UE细菌组对Zn2+去除率分别为45.21%，42.33%和42.98%)，去除率随时间变化不明显，无快速上升阶段，且脲酶工程菌的添加对利用MICP技术去除Zn2+并无有益作用，部分原因为高浓度的Zn2+抑制了菌体繁殖和脲酶活性[25]，从而导致利用MICP技术沉淀Zn2+效果不佳，因此须要进一步优化Zn2+浓度及菌体量以提高对Zn2+的去除率．2.2　金属晶体状态观察本研究通过SEM观察重金属矿化晶体的聚集状态、成型方式、菌孔等(见图2)．如图2(a)所示，在锌离子矿化沉淀晶体上观察到直径约1 μm的小孔，为菌体分解后留下的菌斑，菌斑的形成过程为：在MICP过程中，尿素分解菌分解尿素产生的碳酸根与重金属离子作用，生成碳酸盐沉淀，同时带有负电荷的细菌表面基团可以结合二价阳离子(如Zn2+)，为方解石的沉积提供了理想的成核位点，碳酸盐在细菌表面沉淀之后，细菌被碳酸盐包裹而失去活性，其菌体分解形成菌斑．从图2(b)~(e)中可以看到破碎菌体分布在金属晶体表面，图2(f)中可看到碳酸盐晶体中富含Cd元素(图中红色元素)．除细胞本身外，细胞外聚合物(EPS)也可作为碳酸盐晶体形成的成核位点；因此，巴氏芽孢八叠球菌及其分泌物均可作为重金属沉淀的成核中心，有助于通过生物矿化除去水中的重金属离子．10.13245/j.hust.230419.F002图2SEM观察重金属矿化晶体的聚集状态、成型方式、菌孔等据图2(b)和(d)中锌离子矿化沉淀晶体和铜离子矿化沉淀晶体尺寸大小，判断得出图2(d)中左侧圈内处为铜离子矿化沉淀晶体，右侧圈内处为锌离子矿化沉淀晶体．可见：不同金属离子的碳酸盐晶体尺寸大小相差很大，铜离子矿化沉淀晶体尺寸远大于锌离子矿化沉淀晶体．在混合重金属处理样品中，观察到不同重金属矿化沉淀晶体数量也存在明显差异，铜离子矿化沉淀晶体数量远多于锌离子矿化晶体数量，这与之前所得到的对Cu2+去除率远高于Zn2+的结果一致．2.3　通过酸处理证实沉淀晶体为碳酸盐在稍过量的硝酸与沉淀充分混合摇匀后，发现SP+Zn2+和SP+UE+Zn2+溶液中均有气泡产生，SP+Cu2+和SP+UE+Cu2+溶液中蓝色沉淀迅速变为白色，并且所有样品中均存在不溶于酸的沉淀．根据MICP反应原理，酸处理产生气泡的试验组中产生了重金属碳酸盐沉淀，含铜沉淀为深蓝色，所以判断SP+Cu2+和SP+UE+Cu2+样品中蓝色沉淀为铜离子的矿化沉淀产物，其中不溶解的白色沉淀部分可能为培养基．对酸处理液中的重金属离子浓度进行测定，发现Zn2+的质量浓度很高，为2 155 mg/L；Cu2+为9 mg/L；Ni2+和Cd2+的质量浓度低于仪器检测下限(见表2)．酸处理试验和酸处理溶液中重金属离子定量分析结果说明：在经MICP处理的重金属矿化沉淀中，Zn2+矿化沉淀质量浓度最多，Cu2+矿化沉淀和Ni2+矿化沉淀质量浓度较少，Cd2+矿化沉淀质量浓度非常少，这与模拟重金属污染废水中重金属添加量相符合．10.13245/j.hust.230419.T002表2不同重金属去除率和酸处理液中质量浓度对比金属模拟废水中重金属离子质量浓度/(mg∙L-1)最高去除率/%酸处理液中重金属离子质量浓度/(mg∙L-1)Cd2+8.795.05—Cu2+1 264.072.329Ni2+105.098.65—Zn2+1 589.042.982 1553 讨论与总结本研究通过MICP方法处理含有Cu2+，Cd2+，Zn2+或Ni2+的单一重金属模拟废水．研究发现：MICP技术对Cu2+，Ni2+和Cd2+的去除率较好，均可达到70%以上，而对Zn2+的去除率较差(40%)．与对照菌相比，脲酶工程菌主要对Cd2+的作用较明显，去除率为对照菌的两倍．同时本研究对重金属离子生物矿化沉淀的形貌及成核位点进行了分析，并且经酸处理确认重金属主要是以碳酸盐形式固定．虽然微生物诱导的生物矿化技术可沉淀重金属离子，但同一微生物对不同重金属的沉淀效率也会有所不同．例如Acinetobacter sp．H12对钙离子和镍离子的去除率就有较大差异，72 h内去除率分别达到84.96％和56.67％[25]．因此，筛选特异性沉淀某种重金属离子的微生物可有效提高处理重金属废水的高效性和特异性．在受污染的环境中，野生菌已经习惯于重金属废水环境并进化出一些应对废水中重金属离子的策略，故具有较好的处理重金属废水的潜力．野生菌生理特性不明晰，因此其处理重金属污染的机制不清楚，而工程菌的生物学特性已被熟知，且可以以特定机制定制工程菌，故本研究将人工构建工程菌与野生菌的工作能力进行了对比．结果表明：人工构建的工程菌对Cd2+的去除效果明显优于野生菌，说明构建工程菌替代野生菌的思路是可行的，但其对其他重金属离子的工作性能仍有待进一步加强．可采用合成生物学手段优化工程菌的脲酶活性及增加碳酸酐酶活性，即促进氨基甲酸分解形成碳酸根，从而大幅提高MICP处理重金属污染的效率．此外，微生物诱导重金属离子形成碳酸盐沉淀的过程受环境因素影响较大，未来研究中应该增加环境因素与矿化菌的适配性筛选，探索目标微生物定植和激发的最优方案．综上所述，本研究结果表明：MICP方法可以有效沉淀溶液中的重金属离子，为人工治理重金属污染、新型生物材料的发展提供了新思路．同时，通过比较野生型菌和实验室构建工程菌对不同重金属的处理效果，寻找处理特定重金属污染效率更高的菌株，便于在日后当应对不同种类的重金属污染时，优选出特异性治理该种重金属污染的菌株，也为构建沉淀谱系广的全能工程菌提供了基础数据．此外，本研究结合矿物学和生物学新兴技术，探索生物矿化过程生成碳酸盐及沉淀重金属离子的机理，可为日后人工治理重金属污染、新型生物材料的发展奠定理论基础．