宫颈癌（cervical cancer，CC）是全球女性中仅次于乳腺癌和结直肠癌的恶性肿瘤［1］。人乳头瘤病毒（human papilloma virus，HPV）是宫颈癌最主要的致病因素［2］，虽然目前化疗和放射治疗可实现高度局部控制，但转移性疾病复发依旧会影响患者生存，严重威胁生命［3］。钙黏蛋白18（Cadherin 18， CDH18），也被称作CDH14，是一种分布在细胞膜上的Ⅱ型经典钙黏蛋白，主要在生殖和神经系统中表达［4］。据文献［5］报道，CDH18基因在胃癌中以抑癌基因的角色调控磷脂酰肌醇3 -激酶/蛋白激酶B信号通路（phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B，PI3K/AKT）通路并发挥抑制肿瘤进程的作用。同时，又有研究［6］报道，CDH18基因是妊娠糖尿病的潜在致病基因，并且与糖代谢相关，参与该病的发生和发展。该研究旨在探究CDH18基因对宫颈癌SiHa和HeLa细胞增殖和迁移作用的分子机制。1材料与方法1.1主要细胞、试剂和仪器主要细胞和试剂：细胞培养所需SiHa和HeLa细胞系购自武汉普诺赛生命科技有限公司；主要细胞和试剂：细胞培养所需SiHa和HeLa细胞系购自武汉普诺赛生命科技有限公司；EdU Imaging Kits（Cy3）试剂盒（货号：K1075）购自上海伟寰生物科技有限公司；PEI转染试剂（货号：PR40001）、β-catenin Monoclonal antibody（货号：66379-1-Ig）购自武汉三鹰生物技术有限公司；Wnt/β-catenin信号通路抑制剂XAV939（货号：HY-15147 ）购自上海皓元生物医药科技有限公司；CDH18基因过表达和敲低质粒购自上海吉玛制药技术有限公司；CDH18多克隆抗体购自杭州华安生物技术有限公司（货号：CBG0208A）；T细胞因子/淋巴样增强因子（transcription factor 4，TCF4）单克隆抗体（货号：CY8810）和糖原合成酶激酶-3（glycogen synthase kinase-3 ，GSK-3β）单克隆抗体（货号：AY0503）购自上海埃必威生物技术有限公司；c-Myc（细胞髓细胞瘤病癌基因，cellular myelocytomatosis oncogene）单克隆抗体（货号：bs-4963R）购自北京博奥森生物技术有限公司；Mouse Anti-GAPDH mAb（货号：TA-08）和山羊抗小鼠IgG/辣根过氧化物酶标记（货号：ZB-2305）购自北京中杉金桥生物技术有限公司；CY3 标记山羊抗小鼠IgG（货号：GB21301）购自武汉塞维尔生物科技有限公司。实验仪器与设备：CO2恒温细胞培养箱（美国Thermo fisher公司，型号：308261-2731）；荧光倒置显微镜（日本奥林巴斯公司，型号：8E47050）；细胞超净台（上海力辰科技有限公司，型号：MSC 1.2）；高速冷冻离心机（德国艾本德股份公司，型号：Multifuge×1R）；垂直电泳槽、电转仪和酶标仪（美国Bio-Rad生物工程公司，型号：552BR002366、041BR316470、10295）；正置荧光显微镜（日本尼康公司，型号：Nikon Eclipse C1）。1.2细胞培养及抑制剂XAV939的配制使用添加了含有10%~15%的胎牛血清和500 μL的青链霉素的完全培养基在37 ℃、CO2培养箱中培养，同时，XAV939用DMSO稀释成浓度为20 μmol/L的母液，并将母液稀释至实验所需浓度（1、2、4、8、16 μmol/L）进行后续实验。1.3构建稳定转染细胞株1.3.1构建过表达CDH18基因和敲低CDH18基因的质粒构建过表达CDH18基因的质粒，质粒均由上海吉玛基因公司协助设计和构建。基因名称为homo CDH18，克隆载体为pcDNA3.1（+），克隆位点为BamHI/EcoRI。过表达载体的抗生素为：氨苄霉素（Ampicillin），图1A为过表达载体pcDNA3.1（+）图谱。同时构建敲低CDH18基因的质粒，质粒均由上海吉玛基因公司协助设计和构建。基因名称及靶位点为CDH18-Homo-1050和CDH18-Homo-2603，载体名称为pGPU6/GFP/Neo-CDH18-Homo-1050和pGPU6/GFP/Neo-CDH18-Homo-2603，靶序列为5'-A TGACCCTACCTATGGAAACA-3'和5'-TCCACCCTG GAAAGCATAGAT-3'，敲低载体的抗生素为：卡那霉素（Kanamycin），载体质粒图谱见图1B。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.06.017.F001图1过表达CDH18基因（A）和敲低CDH18基因（B）质粒图谱Fig. 1Plasmid map of CDH18 gene overexpression （A）and CDH18 gene knockdown （B） constructs10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.06.017.T001表1敲低CDH18基因的质粒序列信息Tab. 1Sequence information of CDH18 gene knockdown plasmidGeneLocusSequence（5′-3′）Sh-CDH18-1050Sh-CDH18-2603CDH18-Homo-1050CDH18-Homo-2603ATGACCCTACCTATGGAAACATCCACCCTGGAAAGCATAGAT1.3.2稳定转染细胞株用PEI转染试剂分别稳定转染SiHa和HeLa两种细胞株，将细胞接种于6孔板中，待到细胞的密度达到约70%左右，用PEI转染试剂进行稳定转染，48~72 h后用含有400 μL G418的完全培养基逐渐筛选出稳定转染成功的细胞。建立NC敲低对照组、2个敲低CDH18基因实验组、NC过表达对照组和过表达CDH18基因实验组，分别命名为shNC组、shCDH18-1组、shCDH18-2组、NC组、 OE-CDH18组。1.4EdU细胞增殖实验在96孔板内每孔铺大约8 000个细胞，加入浓度为10 μmol/L的EdU工作液，在37 ℃、5% CO2条件下孵育约2 h后，加入4%多聚甲醛室温固定15 min后洗细胞3次，并加入0.5% Triton X‑100通透20 min。按照试剂盒说明配置Click反应液，室温避光孵育30 min后洗涤细胞，再用DAPI染色细胞核5 min，最后用荧光显微镜观察并采集图像，通过统计EdU阳性细胞占总细胞的比例来评估细胞增殖能力。1.5细胞活力测定细胞接种于96孔板，一般每孔1×10³~3×10⁴个细胞，每孔培养基体积200 μL，每组至少5个复孔，随后转移至37 ℃ CO2培养箱贴壁培养。细胞贴壁后，加入含不同浓度XAV939的培养基，并设置培养时间（24、48、72 h）。分别在每个时间点每孔加入20 μL MTT试剂，培养箱继续孵育3 h。吸弃孔内上清液，每孔加入150 μL DMSO，将96孔板置于摇床上振荡15 min，酶标仪设置波长为490 nm，读取各孔吸光度（absorbance， A）值。1.6Western blot实验采用BCA法用酶标仪读取A值，计算样品蛋白浓度。根据定量结果并上样，随后进行SDS-PAGE凝胶电泳，转膜，封闭，在4 ℃冰箱进行一抗（CDH18多克隆抗体；β-catenin、GSK-3β、c-Myc和TCF4等单克隆抗体；稀释比例均为1∶1 000）孵育过夜。次日回收一抗，1×TBST洗膜3次，每次10 min，加入稀释好的对应种属二抗工作液（山羊抗小鼠IgG/辣根过氧化物酶标记，稀释比例为1∶5 000；山羊抗兔 IgG/辣根过氧化物酶标记，稀释比例为1∶10 000），室温孵育2 h，弃二抗，1×TBST洗膜3次。放入化学发光成像仪中，根据信号强度调整曝光时间，获取条带图像。1.7Transwell实验进行细胞计数，在24孔板下室加入600 μL含15% FBS的培养基。用镊子将小室置于24孔板内，取细胞悬液和完全培养基混合液一共200 μL加入上室，培养箱中培养36 h后收样，用棉签轻轻擦拭上室内的细胞，加入4%多聚甲醛固定30 min，用结晶紫染色30 min，1×PBS洗3遍，除去未与细胞结合的结晶紫，在显微镜下选取3个视野观察细胞并计数。1.8细胞划痕实验在6孔板铺板并确保每个孔的细胞数量为4×105个，在37 ℃ CO2培养箱中培养至细胞融合率达到100%后用200 μL枪头竖直在孔底部划3条竖线，并用记号笔比着6孔板盖子或板底部画3条横线，用1× PBS清洗2次并加入新的无血清或低血清培养基，在0 h和24 h保持同一时间拍照，观察细胞迁移和愈合能力。1.9激光共聚焦荧光显微镜实验将细胞接种于6孔板中，次日，使用4%多聚甲醛固定15 min。加入2 mL 1× PBS，在环形摇床上，以转速80~120 r/min洗2 min，洗3次。加入200 μL浓度为0.2%的Triton试剂，计时3 min。随后用1× PBS洗3次。加入2 mL浓度为5%的BSA封闭液，放入提前预热至37 ℃的温箱内，计时30 min。取2个1.5mL Ep管，分别加入800 μL 5% BSA，再加入β-Catenin抗体，在孔底的位置加入1∶100的200 μL的β-Catenin一抗，4 ℃孵育24 h。孵育结束后，放置在37 ℃的温箱内复温30 min。加入1∶500的200 μL鼠抗，置于37 ℃温箱内孵育2 h。全程避光操作。孵育结束后，用1× PBS洗4次。在孔底的位置加入200 μL DAPI染液，计时15 min。滴入抗荧光淬灭剂，覆盖皿底，等待拍摄。1.10生物信息学预测STRING数据库（http：//cn.string-db.org）对与CDH18有相互作用的分子进行全面分析，生物信息学AutoDock软件（http：//autodock.scripps.edu）完成XAV939和β-连环蛋白的分子对接。1.11统计学处理采用ImageJ对数据进行整理，每组实验重复3次，所有数据统计分析采用SPSS 26.0，两组数据对比采用独立样本t检验，多组比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1宫颈癌细胞中CDH18与β-catenin有一定相关性用生物信息学STRING数据库（http：//cn.string-db.org）对与CDH18有相互作用的分子进行全面分析，核心交叉图谱筛选出5个相关基因（图2A），其中CTNNB1相关性最高。并用HiDock分子对接软件（http：//www.hidock.org）对CDH18与β-catenin进行对接分析，并发现二者的结合位点（图2B）。将过表达CDH18基因的质粒分别稳定转染至SiHa和HeLa两种细胞系，Western blot验证结果显示其转染成功，差异有统计学意义（图2C）（t=61.30、38.80，均P0.001）。最后用激光共聚焦荧光显微镜检测过表达CDH18基因是否影响β-catenin在细胞质和细胞核的分布，结果显示（图2D），过表达CDH18基因后，与NC对照组相比，β-catenin在细胞核与细胞质中的荧光强度均增强，差异有统计学意义（t=17.12、26.43，均P0.01），证明过表达CDH18基因可促进β-catenin表达水平并刺激β-catenin大量进入细胞核。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.06.017.F002图2宫颈癌细胞中CDH18与β-catenin相互作用及对其细胞内分布影响分析Fig.2Analysis of the interaction between CDH18 and β-Catenin and its effects on their intracellular distribution in cervical cancer cellsA： STRING database was used to predict molecules interacting with CDH18 protein； B： HiDock molecular docking software was used to perform docking analysis between CDH18 and β-catenin； C： Western blot assay was used to verify the transfection efficiency in SiHa and HeLa cells； D： Laser confocal microscopy was used to detect the fluorescence intensity of β-catenin ×100； **P0.01， ***P0.001 vs NC group.2.2过表达CDH18基因通过Wnt/β-catenin信号通路促进宫颈癌细胞的增殖和迁移能力为了探究过表达CDH18基因对Wnt/β-catenin信号通路分子表达的影响，用Western blot检测β-catenin、GSK-3β、TCF4和c-Myc这4个Wnt/β-catenin信号通路关键分子蛋白质表达水平，结果显示，CDH18基因的上调激活了β-catenin、c-Myc和TCF4的表达，降低了SiHa细胞GSK-3β的表达，差异有统计学意义（图3）（t=50.70、93.60、16.70、33.94、12.58、17.13、55.30，均P0.05）。EdU实验、Transwell实验和细胞划痕实验检测结果显示，CDH18过表达组细胞增殖数量较对照NC组显著增多，细胞穿膜能力和愈合能力也显著增强，差异有统计学意义（图4A-4C）（t=5.27、11.40、12.73、17.36、8.46、18.14，均P0.05）。提示过表达CDH18基因可以通过调控Wnt/β-catenin信号通路从而增强宫颈癌细胞的增殖和迁移能力。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.06.017.F003图3过表达CDH18基因对Wnt/β-catenin信号通路分子蛋白表达水平影响分析Fig.3Analysis of the effects of CDH18 gene overexpression on the expression levels ofmolecular proteins in the Wnt/β-catenin signaling pathway*P0.05， **P0.01， ***P0.001 vs NC group.10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.06.017.F004图4过表达CDH18基因通过Wnt/β-catenin信号通路对宫颈癌细胞的增殖和迁移能力影响分析Fig.4Analysis of the effects of CDH18 gene overexpression on proliferation and migration capacity of cervical cancer cellsthrough the Wnt/β-catenin signaling pathwayA： Transwell assay was used to detect cell migration ability ×100； B： Wound healing assay was used to measure cell migration ability ×100； C： Wound healing assay was used to measure cell migration ability ×100； *P0.05， **P0.01 vs NC group.2.3宫颈癌细胞中敲低CDH18基因后抑制β-catenin表达将敲低CDH18基因的质粒分别稳定转染至SiHa和HeLa两种细胞系，Western blot实验显示其转染成功，差异有统计学意义（图5A）（t=219.70、184.20、78.00、13.77，均P0.01）。激光共聚焦荧光显微镜检测结果显示（图5B），与NC组相比，CDH18基因敲低后，β-catenin在细胞核与细胞质中的荧光强度均减弱，差异有统计学意义（t=14.50、178.00、46.74、14.02，均P0.05）。证明敲低CDH18基因可以抑制β-catenin表达水平并阻碍β-catenin进入细胞核。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.06.017.F005图5宫颈癌细胞中敲低CDH18基因后对β-catenin表达水平影响分析Fig.5The effects of CDH18 gene knockdown on β-Catenin expression in cervical cancer cellsA： Western blot was used to verify the transfection efficiency in SiHa and HeLa cells； B： Laser confocal microscopy was used to detect the fluorescence intensity of β-catenin ×100； @P0.05， @@P0.01， @@@P 0.001 vs shNC group.2.4敲低CDH18基因通过Wnt/β-catenin信号通路抑制宫颈癌细胞的增殖和迁移能力在宫颈癌细胞SiHa和HeLa中敲低CDH18基因后，用Western blot检测β-catenin、GSK-3β、TCF4和c-Myc这4个Wnt/β-catenin信号通路关键分子蛋白质表达水平，结果显示，敲低CDH18基因抑制了β-catenin、c-Myc和TCF4的表达，增强了GSK-3β的表达，除了SiHa细胞shCDH18-2组GSK-3β蛋白表达水平没有统计学意义，其余均有统计学意义（图6A）（t=179.90、259.40、83.32、33.52、67.23、130.00、31.56、1.51、16.21、45.48、24.12、70.91、105.40、39.79、94.08、83.92，均P0.05）。EdU实验、Transwell实验和细胞划痕实验结果显示，敲低CDH18后，细胞增殖数量较NC组减少，并且细胞穿膜能力和愈合能力也减弱，差异具有统计学意义（图6B、7A-7C）（t=5.05、5.51、16.88、13.25、57.24、51.62、2.89、3.52、56.50、38.74、4.67、11.33，均P0.05）。提示敲低CDH18基因可以通过调控Wnt/β-catenin信号通路从而抑制宫颈癌细胞的增殖和迁移能力。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.06.017.F006图6敲低CDH18基因对Wnt/β-catenin信号通路分子蛋白表达水平以及增殖能力影响分析Fig. 6Analysis of the effects of CDH18 gene knockdown on molecular protein expression levelsand proliferative capacity in the wnt/β-catenin signaling pathwayA： Western blot was used to detect the protein expression levels of molecules associated with the Wnt/β-catenin signaling pathway； B： EdU assay was used to detect cell proliferation ability ×100； @P0.05， @@P0.01， @@@P0.001 vs shNC group.10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.06.017.F007图7敲低CDH18基因通过Wnt/β-catenin信号通路对宫颈癌细胞迁移能力影响分析Fig.7Analysis of the effects of CDH18 gene overexpression on migration capacity of cervical cancer cells through the Wnt/β-catenin signaling pathwayA： Transwell assay was used to detect cell migration ability ×100； B： Wound healing assay was used to measure cell migration ability ×100； @P0.05， @@P0.01， @@@P0.001 vs shNC group.2.5XAV939以剂量依赖性方式抑制Wnt/β-catenin信号通路的表达为了评估β-catenin抑制剂XAV939（图8A）对Wnt/β-catenin信号通路表达的影响，分析二者的亲和力（图8B），对接打分值小于-5.0大于-7.0，表明化合物小分子与靶点具有较好的结合能力［7］。用生物信息学AutoDock软件（http：//autodock.scripps.edu）软件完成XAV939和β-catenin的分子对接（图8C）。在SiHa和HeLa细胞中，分别加入XAV939，并设置0、1、2、4、8、16 μmol/L浓度梯度来评估XAV939对细胞的毒性作用，MTT结果显示，SiHa和HeLa细胞存活率下降，且XAV939对SiHa和HeLa细胞的IC50分别是1.719 μmol/L和1.304 μmol/L（图8E）。Western blot结果也证实XAV939以剂量依赖性方式抑制β-catenin的蛋白表达水平（图8D）（F趋势=227.90、222.70，P0.001）。与NC组比较，OE-CDH18组TCF4、c-Myc的蛋白表达升高，GSK-3β的蛋白表达降低（SiHa：tGSK-3β=44.96，tc-Myc=14.11；HeLa：tGSK-3β=157.70，tTCF4=8.53，tc-Myc=60.96，均P0.05）；与此同时，在过表达CDH18基因的SiHa和HeLa细胞中加入XAV939，结果显示与OE-CDH18组比较，OE-CDH18+XAV939组c-Myc和TCF4的蛋白表达降低，GSK-3β的蛋白表达升高（SiHa：tGSK-3β=3.56，tTCF4=82.29，tc-Myc=101.40；HeLa：tGSK-3β=29.36，tc-Myc=27.43；均P0.05）（图8F）。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.06.017.F008图8XAV939对Wnt/β-catenin信号通路的表达水平影响分析Fig.8Analysis of XAV939 mediated regulation of the wnt/β-catenin signaling pathwayA： Chemical structure of XAV939； B： Binding energy score of molecular docking between XAV939 and β-catenin； C： Schematic diagram of molecular docking between XAV939 and β-catenin； D： Protein expression level of β-catenin in cervical cancer cells treated with different concentrations of XAV939 detected by Western blot； E： IC50 value of XAV939 against cervical cancer cells determined by MTT assay； F： Protein expression levels of molecules related to the Wnt/β-catenin signaling pathway detected by Western blot； a： NC group； b：OE-CDH18 group； c： OE-CDH18 group+XAV939 group； &&&P0.001 vs 0 μmol/L group； *P0.05， **P0.01， ***P0.001 vs NC group； #P0.05， ##P0.01， ###P0.001 vs OE-CDH18 group.2.6XAV939通过Wnt/β-catenin信号通路从而抑制宫颈癌细胞增殖和迁移能力为了进一步探究XAV939是否能通过对Wnt/β-catenin信号通路的抑制作用从而影响宫颈癌细胞增殖和迁移能力，在过表达CDH18基因的SiHa和HeLa细胞中加入XAV939，结果显示XAV939显著消除了CDH18基因过表达对宫颈癌细胞增殖和迁移能力的促进作用，与NC组比较，OE-CDH18组增殖和迁移能力增强（SiHa：t增殖=19.45，t迁移=4.65、8.19；HeLa：t增殖=13.51，t迁移=10.96、6.92；均P0.05）；与此同时，在过表达CDH18基因的SiHa和HeLa细胞中加入XAV939，结果显示与OE-CDH18组比较，OE-CDH18+XAV939组增殖和迁移能力降低（SiHa：t增殖=4.20，t迁移=9.83、13.02；HeLa：t增殖=10.42，t迁移=23.70、6.55；均P0.05）（图9A-9C），进一步证明CDH18基因通过Wnt/β-catenin信号通路影响宫颈癌细胞增殖和迁移能力。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.06.017.F009图9XAV939通过Wnt/β-catenin信号通路影响宫颈癌细胞增殖和迁移能力影响分析Fig.9The effects of XAV939 on proliferation and migration capacity of cervical cancer cells through the wnt/β-catenin pathwayA： EdU assay was used to detect cell proliferation ability ×100； B： Transwell assay was used to detect cell migration ability ×100； C： Wound healing assay was used to detect cell migration ability ×100； a：NC group；b：OE-CDH18H group；c：OE-CDH18+XAV939 group； *P0.05， **P0.01， ***P0.001 vs NC group； #P0.05， ##P0.01 vs OE-CDH18 group.3讨论CDH18是一种钙黏蛋白，不仅介导钙依赖性细胞间黏附，在组织和细胞增殖和分化中也发挥着重要作用［8］。CDH18可能作为治疗胶质瘤的治疗靶点，抑制胶质瘤细胞的侵袭和迁移［9］，CDH18基因在卵巢癌中低表达并发挥抑制细胞生物学行为的作用［10］，同时，CDH18基因也作为高遗传风险因子成为儿童言语水平失用症和声音障碍的发病诱因［11］。本研究旨在揭示在宫颈癌细胞中过表达和敲低CDH18基因后通过Wnt/β-catenin信号通路对宫颈癌增殖和迁移能力的影响。β-catenin在Wnt/β-catenin信号通路中发挥核心作用，该通路对胚胎发育和成人干细胞的调控、稳态和组织再生至关重要，在人类疾病，尤其是癌症的起始和发展有关键作用［12］。GSK-3β是Wnt/β-catenin信号通路的核心负调控因子，促使β-catenin降解，导致β-catenin在Wnt/β-catenin信号通路的表达水平降低［13］。c-Myc和TCF4是Wnt/β-catenin信号通路下游的重要转录因子，涉及多种细胞过程，包括增殖、分化、细胞凋亡和代谢［14］。本研究显示，CDH18基因使宫颈癌细胞中β-catenin，c-Myc和TCF4的蛋白表达水平显著升高，GSK-3β蛋白表达水平显著降低，抑制细胞质中降解β-catenin的能力，因此细胞质中的β-catenin显著增多，β-catenin大量入核。同时，β-catenin进入细胞核与TCF4结合并激活靶基因c-Myc，进而促进细胞增殖和迁移能力。相反，敲低CDH18基因后，β-catenin、c-Myc和TCF4表达水平显著降低，GSK-3β蛋白表达水平显著升高，β-catenin在细胞质中的表达减弱，并抑制其入核；Wnt/β-catenin信号通路活性被抑制，细胞增殖和迁移能力减弱，表明CDH18基因通过Wnt/β-catenin信号通路影响宫颈癌细胞的增殖和迁移能力。XAV939是一种调控Wnt/β-catenin信号通路的小分子抑制剂，促进β-catenin的降解，最终阻断经典Wnt/β-catenin信号通路［15］。本研究结果显示，随着XAV939浓度的增加，宫颈癌SiHa和HeLa细胞中β-catenin的蛋白表达水平呈浓度依赖性降低，在过表达CDH18基因的宫颈癌细胞中加入XAV939，发现c-Myc和TCF4的蛋白表达水平显著降低，并且逆转了过表达CDH18基因对宫颈癌细胞增殖和迁移能力的促进作用，这进一步说明CDH18与Wnt/β-catenin信号通路的相关性。综上所述，本研究表明CDH18基因可以通过Wnt/β-catenin信号通路影响宫颈癌细胞的增殖和迁移能力，为深入探索CDH18基因在宫颈癌细胞中的作用分子机制提供了新的观点和依据，为更好地控制宫颈癌肿瘤细胞的生长、防治宫颈癌提供了理论依据。