原发性干燥综合征（primary sjögren's syndrome， pSS）是一种以淋巴细胞浸润外分泌腺为特征的系统性自身免疫性疾病。其发病机制复杂，涉及遗传易感性、环境触发、先天性与适应性免疫应答异常等多个环节［1–2］。近年研究［3–4］表明，免疫原性细胞死亡（immunogenic cell death，ICD）作为一种特殊的程序性细胞死亡形式，在连接细胞应激损伤与系统性自身免疫启动中可能发挥桥梁作用。ICD过程中释放的损伤相关分子模式（damage-associated molecular patterns， DAMPs）可激活抗原呈递细胞，进而启动特异性T细胞免疫［5–7］。理论上，自身抗原持续暴露与伴随的ICD事件可能通过“自身抗原-DAMPs-干扰素”正反馈环路，驱动pSS从局灶性腺体炎症向全身性自身免疫疾病演进。然而，目前关于ICD核心分子在pSS病理进展中的系统筛选与验证研究仍较为有限，尚缺乏基于多组学数据与实验验证相结合的分析。该研究旨在系统筛选并验证pSS中关键的ICD相关基因，为深入解析ICD在pSS免疫病理机制中的作用提供实验依据和潜在治疗靶点。1材料与方法1.1pSS差异表达基因筛选本研究所用基因表达数据来源于NCBI-GEO数据库。训练集为GSE66795，包含131例pSS患者及29例健康对照者的外周血样本。数据集基于GPL10558平台，探针注释后，剔除未匹配基因的探针；若多个探针对应同一基因，则取表达均值作为该基因的表达量。采用R 4.3.0软件limma包对GSE66795数据集进行差异表达分析。筛选标准为：P0.05且|Log₂FC|1.5。绘制火山图与热图，可视化差异表达基因的表达模式及显著性。1.2ICD相关基因集构建通过系统检索近年文献［8–9］，共纳入55个ICD相关核心基因，包括胱天蛋白酶（Caspase-1， CASP1）、叉头框蛋白P3（forkhead box P3， FOXP3）、干扰素γ（interferon-gamma， IFNG）、Toll样受体7（Toll-like receptor 7， TLR7）、DExD/H盒螺旋酶58（DExD/H-box helicase 58， DDX58）和干扰素诱导解旋酶C结构域1（interferon induced with helicase C domain 1， IFIH1）等，用于后续交集分析。1.3pSS疾病靶点获取基于GeneCards（https：//www.genecards.org）与DisGeNET（https：//disgenet.cn）数据库，以“Primary Sjögren’s syndrome”为关键词检索并整合1 380个pSS相关靶点基因，构建疾病基因集。1.4基因交集分析利用EVenn在线工具（http：//www.ehbio.com/test/venn/）构建差异表达基因、ICD基因与pSS疾病靶点的三圆韦恩图，提取三者交集基因，作为后续候选基因。1.5分选CD8⁺ T细胞亚群的转录组GEO数据集GSE93683（含6例pSS患者与6例健康对照）用于分选CD8⁺T细胞亚群的转录组，涵盖CD45RO⁻ memory、central memory、effector memory及naive CD8⁺T细胞亚群。对候选基因在各亚群中的表达水平进行比较，采用Mann-Whitney U检验评估组间差异，显著性水平设为P0.05。1.6实验验证1.6.1研究对象本研究纳入贵州中医药大学第二附属医院10例pSS患者与4例健康对照唇腺组织。pSS诊断符合2016年ACR/EULAR分类标准，健康对照无自身免疫病史及口干眼干症状，近3个月内未使用影响腺体分泌药物。排除合并其他自身免疫病、感染性疾病、恶性肿瘤、妊娠或哺乳期女性及无法配合完成检测者。本研究方案经贵州中医药大学第二附属医院医学伦理委员会审查批准（批件号：KY20240101），所有受试者在参与研究前均签署了书面知情同意书。1.6.2RT-qPCR验证主要仪器与试剂：RNA提取采用TriQuick Reagent（北京索莱宝科技有限公司，货号：R1100），逆转录使用Evo M-MLV RT Mix Kit（湖南艾科瑞生物工程有限公司，货号：AG11728），qPCR采用PerfectStart® Green qPCR SuperMix（北京全式金生物有限公司，货号：AQ602）。引物序列由上海生工合成。外周血白细胞分离：取新鲜抗凝血，按比例加入红细胞裂解液，混匀后冰上静置10~15 min，4 ℃、2 000 r/min 离心5 min，弃上清液；沉淀加裂解液重悬，再次4 ℃、2 000 r/min 离心5 min，弃上清液；用PBS洗涤1次（4 ℃、2 000 r/min 离心5 min），弃上清液，收集白细胞沉淀，-80 ℃保存备用。唇腺组织处理：新鲜唇腺组织标本于液氮中速冻后转移至-80 ℃保存。RNA提取与逆转录：取白细胞悬液或唇腺组织块，按TriQuick试剂说明书提取总RNA，测定浓度后，使用Evo M-MLV RT Kit进行逆转录，反应体系与程序按照试剂说明书操作。qPCR检测：使用ABI QuantStudio 1系统进行检测，以β-actin为内参，采用2-ΔΔCT法计算相对表达量。1.7统计学处理所有数据分析均采用R 4.3.0与GraphPad Prism 9.5.1软件完成。两组间比较采用Mann-Whitney U检验，P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1外周血白细胞差异表达基因筛选基于GEO数据库GSE66795数据集，对pSS患者与健康对照者的外周血基因表达谱进行比较分析。共筛选出2 601个差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs），其中1 200个基因表达上调，1 401个基因表达下调（图1）。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.06.013.F001图1pSS患者与健康对照外周血转录组差异分析Fig.1Differential transcriptomic analysis of peripheral blood between pSS patients and healthy controlsA： Clustered heatmap of DEGs； each row represents a gene， and each column represents a sample； colors from blue to red indicate expression levels from low to high （Z-score normalized）； B： Volcano plot of DEGs； gray dots represent genes with no significant difference； red dots represent significantly upregulated genes （Log₂FC1.5， P0.05）； blue dots represent significantly downregulated genes （Log₂FC-1.5， P0.05）.2.2ICD、DEGs与pSS疾病靶点的交集分析将ICD核心基因集、pSS差异表达基因（DEGs）与pSS疾病相关靶点基因集进行交集分析，韦恩图展示了三者之间的重叠关系。结果显示，三者的交集共包含7个“ICD-DEGs-pSS”核心基因，分别为CASP1、FOXP3、IFNG、髓样分化因子88（myeloid differentiation primary response， 88MYD88）、TLR7、DDX58和IFIH1，上述基因在pSS中均呈表达上调（图2）10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.06.013.F002图2ICD、DEGs与pSS疾病靶点的交集分析Fig. 2Intersection analysis of ICD， DEGs， and pSS disease targets2.3免疫细胞浸润分析采用CIBERSORT算法对pSS患者与健康对照样本进行免疫细胞浸润分析。结果显示，pSS患者免疫细胞组成发生显著变化（图3）。具体表现为，初始B细胞（t=2.26，P=0.011 5）、CD4⁺活化记忆性T细胞（t=3.09，P=0.002 3）与树突状细胞（t=4.52，P0.000 1）比例显著升高，而记忆B细胞（t=2.59，P=0.010 5）、静息NK细胞（t=2.29，P=0.023 3）与M0型巨噬细胞（t=2.19，P=0.014 8）比例降低。上述结果提示pSS患者存在免疫微环境失衡。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.06.013.F003图3pSS患者与健康对照免疫细胞浸润特征比较Fig. 3Comparison of immune cell infiltration characteristics between pSS patients and healthy controlsA： Stacked bar chart showing the relative proportions of 22 immune cell types in each sample； B： Heatmap comparing the relative proportions of 22 immune cell types between the two groups； C： Box plots comparing the relative proportions of 22 immune cell subsets between the two groups； data were presented as median and interquartile range； *P0.05， **P0.01， ***P0.001 vs Control group.2.4CD8⁺ T细胞亚群的转录组分选基于分选CD8⁺T细胞亚群的转录组数据（GSE93683）进行表达验证显示，在central memory CD8⁺T细胞中，CASP1表达水平高于健康对照（U=4.00，P=0.026）；在effector memory CD8⁺T细胞中，FOXP3表达升高（U=4.00，P=0.026）；而在naive CD8⁺T细胞及CD45RO-memory CD8⁺T细胞中，各候选基因表达差异均无统计学意义（P0.05）（图4）。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.06.013.F004图4核心候选基因在健康对照与pSS患者不同CD8⁺ T细胞亚群中的表达水平Fig. 4Expression levels of core candidate genes in different CD8⁺ T cell subsets between healthy controls and pSS patients*P0.05 vs Control group.2.5RT-qPCR验证结果RT-qPCR检测结果显示，在外周血白细胞中，pSS组CASP1（U=4.00，P=0.023）、DDX58（U=0.00，P=0.002）及IFIH1（U=4.00，P=0.023）及IFNG（U=4.00，P=0.023）的表达水平均显著高于健康对照组。在唇腺组织中，pSS组CASP1（U=4.00，P=0.044）、DDX58（U=0.00，P=0.004）及IFIH1（U=0.00，P=0.004）表达水平显著高于健康对照组，IFNG表达水平显著低于健康对照组（U=4.00，P=0.044）（图5）。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.06.013.F005图5pSS（n=10）与HC（n=4）核心基因mRNA的表达比较Fig. 5Comparison of mRNA expression of core genes between pSS （n=10） and control group （n=4） A-D： The expression of the four genes in peripheral blood leukocytes； E-H： The expression in labial salivary gland tissues； data were presented as median and interquartile range； intergroup comparisons were performed using the Mann-Whitney U test； *P0.05， **P0.01 vs Control group.3讨论本研究通过整合多组学数据与实验验证，系统筛选并验证了pSS中与ICD密切相关的基因。分析结果显示，DDX58、IFIH1、CASP1及IFNG在pSS患者外周血与局部组织中的表达呈现明显改变，提示其在pSS病理过程中可能发挥重要作用。本研究不仅识别了潜在的ICD相关调控基因，也为进一步探索pSS中“自身抗原-DAMPs-干扰素”环路提供了分子层面的实验依据。DDX58基因编码的 RIG-I（维甲酸诱导基因I）以及由IFIH1基因编码的 MDA5（黑色素瘤分化相关基因5），二者均为关键的胞质模式识别受体。在识别病毒RNA及内源性危险信号中起关键作用［10–11］。本研究结果显示，二者在外周血与唇腺组织中均显著上调，提示pSS中可能存在持续的核酸感知通路的异常激活。二者均可通过下游STING通路诱导Ⅰ型干扰素的产生，进而启动并放大自身免疫应答［12］。这与本研究中IFNG在外周血中的高表达现象相吻合，提示全身性干扰素信号的持续激活可能是pSS系统性表现的重要驱动因素。然而，值得注意的是，IFNG在唇腺组织中表达反而下调，这可能与局部免疫微环境中负反馈调节、细胞亚群分布差异或组织特异性降解机制有关，具体机制值得进一步探讨。CASP1作为炎症小体活化的关键执行分子，在ICD过程中直接参与gasdermin D的切割及白介素（interleukin，IL）-1β、IL-18等促炎因子的成熟释放［13–14］。本研究中CASP1在pSS患者两种组织中均显著高表达，提示炎症小体通路在pSS的ICD事件及局部组织损伤中被异常激活。其释放的DAMPs，如高迁移率族蛋白B1（high mobility group box 1，HMGB1）、三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）等可进一步激活抗原呈递细胞，形成“组织损伤-ICD-免疫活化”的恶性循环［15–16］。这为理解pSS从局灶性腺体炎症向系统性自身免疫疾病发展的机制提供了新的视角。免疫浸润分析结果显示pSS唇腺组织中初始B细胞与树突状细胞比例升高，提示局部抗原提呈与B细胞活化增强。而静息NK细胞与M0巨噬细胞比例下降，则可能反映了免疫微环境向促炎状态的转变。值得注意的是，基于分选CD8⁺T细胞亚群的转录组分析发现，CASP1在central memory CD8⁺T细胞中显著高表达，提示该亚群可能在pSS中通过炎症小体通路参与自身免疫反应的维持与记忆性应答，这一发现为理解CD8⁺T细胞在pSS中的作用提供了新的线索。结合前述分子水平的发现，DDX58、CASP1及IFIH1在全身及局部组织中表达的一致性上调，可能在pSS全身及局部病理过程中发挥协同作用；而IFNG在血液与腺体组织中的表达差异，则提示其在系统性免疫激活与局部免疫调控中可能具有不同功能。这些分子与细胞层面的改变共同揭示了pSS免疫病理机制的复杂性。本研究采用生物信息学、免疫细胞分析、转录组验证及实验检测相结合的多层次研究策略，有效识别了传统单一方法可能遗漏的关键基因。这种“数据驱动-实验验证”的研究模式，有助于在复杂疾病背景下识别组织特异性的治疗靶点。然而，该研究仍存在一定的局限性：首先，RT-qPCR验证样本量相对有限，未来需扩大样本进一步确认表达谱的稳定性与临床相关性；其次，本研究侧重于基因表达层面的描述，尚未通过功能实验（如基因敲减、过表达等）验证上述基因在ICD及pSS病理中的直接作用；此外，研究中使用的转录组数据主要来源于外周血，尽管结合了唇腺组织验证，但不同组织、不同疾病阶段的表达异质性仍需进一步解析。综上所述，本研究识别并验证了DDX58、IFIH1、CASP1及IFNG作为pSS中关键的ICD相关基因，提示DDX58/RIG-I与IFIH1/MDA5介导的核酸感知通路可能通过诱导干扰素信号，与CASP1相关的炎症小体通路协同参与疾病进展。IFNG在全身与局部表达的不一致性，凸显了pSS免疫调控的空间复杂性。未来研究应进一步开展功能实验与临床队列分析，明确上述基因在ICD诱导、干扰素信号调控及组织损伤中的具体机制，并探索其在pSS诊断及靶向治疗中的应用潜力。