2026 - 02 - 23 接收结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是临床常见的消化道恶性肿瘤，其发病率在男性和女性人群中均位列第三 ［1］。尽管CRC的治疗取得了较大的进步，但发生转移的患者预后仍极差，是其主要死因之一 ［2］。因此，探索CRC转移的分子机制，筛选新的靶向治疗位点，对于提高CRC疗效及改善预后极为重要。肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages，TAMs）作为肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）主要浸润的免疫细胞，常常表现为M2表型，在促进血管生成、肿瘤发生和转移方面具有重要作用 ［3–5］。TAMs衍生的细胞因子在这些过程中起到关键作用 ［6］。白细胞介素（interleukin， IL）-8是一种促炎因子，已被证明可以诱导血管生成并促进许多癌症的进展，包括CRC ［7］。值得注意的是，在TME中，TAMs被认为是IL-8的主要分泌细胞［8–9］。该文旨在探讨TAMs分泌的IL-8在CRC转移中的作用及其潜在治疗价值。1材料与方法1.1材料1.1.1细胞人源结直肠癌细胞HCT116、鼠源结直肠癌细胞CT26-LUC和人单核细胞白血病细胞THP1（中国科学院上海生命科学研究院）。1.1.2主要试剂RPMI-1640培养基（货号：C11875500BT）、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS，货号：1828728）、青-链霉素溶液（货号：1881450）和胰蛋白酶（货号：1869828）购自美国Gibco公司；佛波酯（phorbol myristate acetate，PMA，货号：524400）购自美国Sigma公司；流式抗体CD11b-PE（货号：555388）和CD206-FITC（货号：551135）及BD Matrigel基质胶（货号：356234）购自美国BD Pharmingen公司；IL-10（货号：EK0416）、转化生长因子-β（transforming growth factor-β， TGF-β，货号：EK0513）和IL-8（货号：EK0413）酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；实时荧光定量聚合酶链反应（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）实验相关实验试剂盒：反转录试剂盒（货号：AG11705）、RT-qPCR试剂盒（货号：AG11732）购自江苏艾科瑞生物科技有限公司；Transwell小室购自美国Corning公司；Western blot实验相关试剂：RIPA裂解液（货号：P0013B）、蛋白浓度快速测定试剂盒（货号：P0398L）及结晶紫染色液（货号：C0121）购自上海碧云天生物技术有限公司；IL-8抗体（货号：27095-1-AP）购自美国Proteintech公司；E-钙黏蛋白（E-cadherin，货号：3195S）抗体购自美国CST公司；N-钙黏蛋白（N-cadherin，货号：ET1607-37）购自杭州华安生物公司；β-actin抗体（货号：ab8227）及鼠二抗（货号：ab6789）、（兔二抗货号：ab6721）购自英国Abcam公司；IL-8受体抑制剂Reparixin（货号：HY-15251）购自美国MedChemExpress公司；IL-4（货号：S0B3158）和IL-13（货号：S0B3237）购自杭州斯达特生物科技有限公司。1.1.3主要仪器细胞恒温培养箱（型号：HERAcell240i）购自美国Thermo Fisher Scientific公司；流式细胞仪（货号：CytoFLEX LX）购自美国Beckman Coulter公司；PCR仪（货号：ABI7300）购自美国Applied Biosystems公司；酶标仪（货号：BioRad-680）购自美国Beckman Coulter公司；电热恒温水浴锅（货号：DK-8D）购自上海精宏实验设备有限公司；垂直电泳仪（货号：165-8001）、凝胶成像仪（货号：Gel-DocEQ）购自美国Beckman Coulter公司；小动物活体成像仪（型号：IVIS Lumina Series Ⅲ）购自美国PerkinElmer公司。1.2实验方法1.2.1细胞培养HCT116细胞、CT26-LUC细胞和THP1细胞用RPMI-1640完全培养基培养在恒温恒湿培养箱中（37 ℃、5% CO2）培养。1.2.2TAMs模型构建和条件培养基（conditioned medium，CM）收集THP1细胞用PMA（200 ng/mL）诱导为贴壁的M0细胞。使用20 ng/mL IL-4和20 ng/mL IL-13刺激M0型巨噬细胞72 h，获得TAMs。CM由相应的巨噬细胞用无血清培养基饥饿48 h后获得，命名为CM-M0和CM-TAMs，在CM-TAMs中加入Reparixin（采用浓度25 μg/mL ［10］），命名为CM-TAMs+Reparixin。1.2.3流式细胞术检测TAMs模型中的M2型巨噬细胞表型收集诱导后的巨噬细胞与流式抗体（CD11b-PE和CD206-FITC）避光共孵育后，用流式细胞仪器检测。1.2.4RT-qPCR实验提取巨噬细胞及与巨噬细胞CM刺激后的HCT116细胞的总RNA并进行逆转录，经RT-qPCR反应，以β-actin为内参，用2-ΔΔCT法计算mRNA的相对表达水平，引物序列如下：β-actin正向引物为5'-ATTGCCGACAGGATGCAGAA-3'，反向引物为5'-GCTGATCCACATCTGCTGGAA-3'；IL-10正向引物为5'-TGCCTTCAGCAGAGTGAAGA-3'，反向引物为5′-GGTCTTGGTTCTCAGCTTGG-3′；TGF-β正向引物为5′-GGGACTATCCACCTGCAAGA-3′，反向引物为5′-CCTCCTTGGCGTAGTAGTCG-3′；IL-8正向引物为5′-ACTGAGAGTGATTGAGAGTGG AC-3′，反向引物为5′-AACCCTCTGCACCCAGTTT TC-3′；E-cadherin正向引物为5′-CTCCCAATACAT CTCCCTTCAC-3′，反向引物为5′-CGCCTCCTT CTTCATCATAGTAA-3′；N-cadherin正向引物为5′-GGCATACACCATGCCATCTT-3′，反向引物为5′-GTGCATGAAGGACAGCCTCT-3′。1.2.5ELISA实验根据ELISA说明书检测CM-M0和CM-TAMs中IL-10、TGF-β和IL-8的水平。1.2.6划痕实验HCT116细胞汇合后用枪头划出直线，用PBS清洗细胞碎片后，根据实验分组加入不同巨噬细胞CM处理，具体为CM-M0、CM-TAMs和CM-TAMs+Reparixin，分别于0 h和48 h拍照。1.2.7Transwell实验迁移实验：HCT116细胞用CM（含10% FBS）培养48 h，收集2×104个细胞加入上室，下室加入700 μL培养基（20% FBS），48 h后用结晶紫染色后拍照。侵袭实验：预先用基质胶包被Transwell上室的底膜，并按照迁移实验的方法完成侵袭实验。1.2.8Western blot法HCT116细胞经CM-M0、CM-TAMs和CM-TAMs+Reparixin刺激48 h后收集全细胞蛋白，同时收集M0和TAMs全细胞蛋白；蛋白样品经电泳和转膜后将蛋白转移至PVDF膜上，封闭后，加入相应的一抗，包括IL-8（1∶1 000）、E-cadherin（1∶1 000）、N-cadherin（1∶1 000）和β-actin（1∶5 000），4 ℃孵育过夜，次日与对应的二抗（1∶2 000）孵育后显影。1.2.9脾注射肝转移模型雄性Balb/c小鼠（SPF级，4~6周，18~20 g）购自上海必凯科翼生物科技有限公司，饲养于SPF级动物房中，CT26-LUC细胞用CM-TAMs刺激48 h，消化后取2×106个细胞注射至小鼠脾脏建立脾注射肝转移模型，并在1周后用活体成像进行验证，取造模成功后的小鼠共10只，随机分成2组，每组5只，分为对照组（生理盐水，腹腔注射）和Reparixin组（15 mg/kg，腹腔注射），每2 d给药1次，2周后活体成像观察肝转移情况。所有动物实验由上海市普陀区中心医院动物伦理委员会审批通过（批件号：DWEC-A-2024-22-1-92）。1.3统计学处理每个实验均重复3次，结果用x¯±s表示，用GraphPad Prism 10进行作图及统计分析，两组之间比较采用独立样本t检验进行统计分析，P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1TAMs模型验证结果流式结果如图1A所示，TAMs模型中M2型巨噬细胞（CD11b+CD206+细胞）比例相比M0巨噬细胞显著升高（图1A，t=21.38，P0.001）。RT-qPCR实验（图1B）与ELISA实验（图1C）表明，M2型巨噬细胞的标志物IL-10（t=8.85、15.84，P0.001）和TGF-β（t=18.49、15.87，P0.001）水平也在TAMs模型中显著升高。这些结果表明TAMs模型构建成功。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.06.002.F001图1TAMs模型验证结果Fig.1The results of TAMs model establishmentA： Flow cytometry results of M0 and TAMs； B， C： RT-qPCR results and ELISA results of IL-10 and TGF-β in M0 and TAMs； ***P0.001 vs M0 group.2.2TAMs对CRC细胞转移的影响划痕实验结果表明，CM-TAMs组处理的HCT116细胞的划痕愈合率相比于CM-M0组明显升高（图2A，t=6.41，P0.01）。Transwell实验结果如图2B所示，CM-TAMS处理的HCT116细胞发生迁移（t=21.57，P0.001）和侵袭（t=7.08，P0.01）的细胞数目增多。这些结果表明TAMs可以促进HCT116细胞转移能力。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.06.002.F002图2TAMs对CRC细胞转移的影响Fig.2The effects of TAMs on CRC cell metastasisA， B： Wound healing results （×50） and Transwell results （×100） of HCT116 after treated with CM-M0 and CM-TAMs； **P0.01， ***P0.001 vs CM-M0 group.2.3TAMs高表达IL-8并促进上皮细胞-间质细胞转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）Western blot结果如图3A所示，TAMs比M0型巨噬细胞IL-8表达更高（t=14.84，P0.001）。同时，RT-qPCR（图3B）和ELISA实验（图3C）也显示TAMs的IL-8（t=5.85、10.96，P0.01）水平更高。Western blot（图3D）和RT-qPCR实验（图3E）结果显示，TAMs下调HCT116细胞的E-cadherin表达水平（t=10.42、3.50，P0.05），上调N-cadherin表达水平（t=8.17、6.30，P0.01）。这些结果表明TAMs高表达IL-8并促进了EMT。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.06.002.F003图3TAMs表达IL-8的水平及其对HCT116细胞EMT的影响Fig.3The expression level of IL-8 in TAMs and its effects on EMT in HCT116 cellsA-C： Western blot results， RT-qPCR results and ELISA results of IL-8 expression in M0 and TAMs； D， E： Western blot results and RT-qPCR results of E-cadherin and N-cadherin expression in HCT116 treated with CM-M0 and CM-TAMs； **P0.01， ***P0.001 vs M0 group； #P0.05，##P0.01 vs CM-M0 group.2.4Reparixin逆转TAMs介导的促转移及EMT作用划痕实验如图4A所示，CM-TAMs+Reparixin组的划痕愈合率相比CM-TAMs组明显下降（t=6.47，P0.01）。Transwell实验如图4B所示，在加入IL-8受体抑制剂后，CM-TAMS+Reparixin组HCT116细胞发生迁移（t=26.04，P0.001）和侵袭（t=15.70，P0.001）的细胞数目相比于CM-TAMs组明显减少。Western blot实验（图4C）和RT-qPCR实验（图4D）结果显示，与CM-TAMs组相比，CM-TAMs+Reparixin组的E-cadherin表达上升（t=12.23、11.23，P0.001），而N-cadherin表达下降（t=17.25、3.43，P0.05）。这些结果表明Reparixin可以逆转TAMs所介导的促转移及EMT。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.06.002.F004图4Reparixin逆转TAMs介导的促转移及EMT作用Fig.4Reparixin reversed the metastasis-promoting and EMT effects mediated by TAMsA， B： Wound healing results （×50） and Transwell results （×100） of HCT116 treated with CM-TAMs and CM-TAMs+Reparixin； C， D： Western blot results and RT-qPCR results of E-cadherin and N-cadherin expression in HCT116 treated with CM-TAMs and CM-TAMs+Reparixin； a： CM-TAMs group；b： CM-TAMs+Reparixin group； *P0.05， **P0.01， ***P0.001 vs CM-TAMs group.10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.06.002.F0052.5Reparixin对脾注射肝转移模型的影响第21天的活体成像结果如图5所示，与对照组相比，Reparixin组中第21天的生物发光强度明显降低（t=13.39，P0.001），这表明IL-8在促进CRC中起了关键作用，而Reparixin可以逆转这种作用。3讨论转移是CRC高病死率的主要原因，这不仅是由癌细胞的复杂改变驱动的，还受到癌细胞与TME成分之间动态相互作用的影响。在TME中，肿瘤细胞与TAMs相互合作可以促进肿瘤转移和进展，一方面肿瘤细胞通过分泌细胞因子、趋化因子、细胞外囊泡等诱导巨噬细胞向M2型极化，另一方面，极化后的M2型TAMs可以促进肿瘤进展和转移 ［11］。文献报道，TAMs不仅可以通过分泌细胞因子和趋化因子来提高循环中CRC细胞的存活率，还可以分泌多种酶，如基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase， MMP）-2、MMP-9和组织蛋白酶，降解细胞外基质成分，从而促进CRC细胞的局部侵袭 ［2］。本研究主要通过构建体外TAMs模型、流式细胞术实验、RT-qPCR和ELISA实验表明TAMs模型构建成功。用CM-M0和CM-TAMs刺激HCT116细胞，划痕实验和Transwell实验表明，TAMs能显著提高HCT116细胞的转移能力。目前，TAMs通过释放外泌体、细胞因子等介导肿瘤生长和转移的作用已在多种肿瘤类型中被证实。例如，有研究 ［12］表明，在炎症诱导的结肠癌小鼠模型中，TAMs已被确定为肿瘤新生血管生成的主要驱动因素，这是通过产生促血管生成因子C-X-C基序趋化因子配体12（C-X-C motif chemokine ligand 12， CXCL12）来实现的。Zhao et al ［13］证明，极化的M2巨噬细胞可以分泌CXCL13，进而激活CXCL13/CXCR5/NFκB/p65/miR-934的正反馈回路，从而诱导CRC中转移前生态位的形成，从而支持转移性肿瘤的建立和生长。Wang et al ［14］发现TAMs分泌外泌体将转移相关肺腺癌转录本1（metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1， MALA T1）传递到胃癌细胞，其中MALAT1稳定了δ-catenin蛋白并上调了HIF-1α的表达，从而促进糖酵解和胃癌进展。Liu et al ［15］发现TAMs分泌的TGF-β可以激活HIF-1α/TRIB3信号通路，从而促进CRC的进展。Zhong et al ［8］发现TAMs高表达IL-8，并通过IL-8/STAT3/GLUT3途径促进糖酵解和胰腺癌进展。EMT是指上皮细胞获得间充质特征的过程，与肿瘤的发生、侵袭、转移和耐药密切相关 ［16］。IL-8是一种促炎趋化因子，有利于转移、侵袭、肿瘤生长和血管生成。在CRC肿瘤细胞中，高水平的IL-8标志着更差的预后。研究 ［17–18］表明IL-8可以诱导EMT促进CRC肝转移。本研究结果显示，构建的TAMs高表达IL-8，同时CM-TAMs刺激HCT116细胞后E-cadherin表达下调，而N-cadherin表达上调，表明TAMs促进HCT116细胞的转移可能与IL-8分泌及EMT诱导有关。为了进一步验证IL-8与EMT诱导之间的关系，本研究利用IL-8受体抑制剂Reparixin处理HCT116细胞，结果显示Reparixin不仅逆转了TAMs所介导的细胞迁移和侵袭，还可抑制其EMT的促进作用。最后，本研究构建了脾注射肝转移模型，结果显示IL-8受体抑制剂干预可以明显抑制肝转移过程。表明TAMs通过分泌IL-8诱导EMT来促进CRC细胞的迁移和侵袭能力。综上所述，TAMs通过分泌IL-8诱导EMT促进CRC侵袭转移，抑制TAMs分泌IL-8或抑制IL-8与其受体结合，可能为CRC靶向治疗提供新的方向。