白细胞介素-9（interleukin-9，Il9）是一类具有多效性的免疫调节细胞因子，其核心分泌细胞包括Th9细胞、肥大细胞，此外，嗜碱性粒细胞、NK细胞等也可少量产生［1–2］。作为免疫网络的关键信号分子，Il9通过与靶细胞表面的Il9受体结合激活下游信号通路，实现免疫调控功能。在过敏性疾病中，它可以促进肥大细胞增殖活化、增强嗜酸性粒细胞浸润、加剧哮喘、特应性皮炎等的炎症反应［2–3］。在自身免疫性疾病领域，Il9能调控免疫细胞失衡，参与类风湿关节炎、多发性硬化症的发病进程。而在肿瘤免疫中，其作用具有双面性，既能激活抗肿瘤免疫应答，也可能通过抑制效应细胞功能促进肿瘤进展，成为相关疾病研究与治疗的潜在靶点。本研究基于DNA同源重组原理，采用常规基因敲除技术并利用特异性gRNA靶向Il9基因外显子区域，旨在C57BL/6N背景下构建稳定、可靠的Il9基因敲除小鼠模型。1材料与方法1.1实验动物C57BL/6N-Il9em1Cya小鼠，雄性，5只，7 周龄，体质量（20±2） g，C57BL/6J遗传背景，该小鼠与赛业（苏州）生物科技有限公司联合构建；生产许可证号：SCXK（苏）2018-003。实验动物通过安徽医科大学药学科学学院临床药理研究所动物实验伦理委员会批准，伦理审查批准号为：PZ-2023-001，并在安徽医科大学药学科学学院临床药理研究所动物实验中心无特定病原体级动物房饲养繁殖。1.2主要试剂sgRNA、Donor载体由赛业（苏州）生物科技有限公司合成；2×Hotstrat Taq PCR Master Mix、50×TAE、Gelred核酸染料10 000×、100 bp Ladder DNA Maker（北京博迈德基因技术有限公司，货号：MT205、EL102-01、EL108、MD112）；琼脂糖Agarose（德国BioFroxx公司，货号：1110GR100）；三色预染蛋白marker（上海雅酶生物医药科技有限公司，货号：WJ103）；磷酸盐缓冲液PBS pH 7.2（上海源培生物科技股份有限公司，货号：B31OKJ）；Il9抗体（货号：66144-1-Ig，武汉三鹰生物技术有限公司）；β-actin 抗体（货号：#T0022，美国 Affinity Biosciences 公司） ；ECL化学发光试剂盒（货号：BL520B，北京兰杰柯科技有限公司）；粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF ）（货号：315-02，美国Peprotech公司） ；F4/80、CD4、CD19流式抗体（货号：123110、302604、390678，美国Biolegend试剂公司）、山羊抗兔IgG二抗（货号：SA00010-1，武汉三鹰生物技术有限公司）。1.3主要仪器CO2培养箱（上海博旅仪器有限公司，型号：P-90A）；通用型电泳仪（北京六一生物科技有限公司，型号：DYY-7C）；荧光定量PCR仪（上海伯乐生命医学产品有限公司，型号：T20）；化学发光成像分析仪（美国GE health care公司，型号：Tanon 1600）；十色流式细胞仪（美国贝克曼库尔特有限公司，型号：A00-1-1102） 。1.4实验方法1.4.1Il9基因敲除小鼠的饲养及繁殖Il9基因敲除小鼠的饲养及繁殖工作均在安徽医科大学药学科学学院临床药理研究所实验动物中心的SPF级动物房内严格开展，全程遵循SPF级实验动物管理标准。温度恒定维持在18~22 ℃，相对湿度稳定控制在40%~70%，采用12 h明暗交替的光照模式，精准模拟自然昼夜节律，为小鼠营造适配其生理需求的生存环境。小鼠的饲养笼具、铺垫垫料、全价基础饲料及饮用水均经过严格的高温高压灭菌处理，确保全程无菌无污染；同时，定期为小鼠补充灭菌葵花籽，以满足其额外的营养需求。科研人员每日进入SPF级动物房，细致观察小鼠的精神状态、进食饮水情况及生长发育进程，并做好实时记录；每周更换笼具垫料2次，及时清理排泄物以保持环境洁净干燥，且持续供应新鲜灭菌饲料与无菌饮用水，为小鼠健康生长提供保障。初期采用Il9基因敲除纯合雄鼠与纯合雌鼠按1∶2比例合笼繁殖。依托小鼠约8周性成熟、妊娠期21 d的生理特性，待培育出F1代纯合子后，进一步选取F1代纯合子仍以1∶2比例合笼交配，旨在获得足量F2代小鼠，为后续基因型鉴定、表型分析及相关功能研究提供充足的实验样本。1.4.2Il9-/-小鼠基因鉴定取3~4周龄F1代小鼠鼠尾片段（3~5 mm），置于1.5 mL EP管中，加入50 μL裂解液（含25 mmol/L NaOH、0.2 mmol/L EDTA，pH 8.0），于95 ℃电热恒温水箱中孵育30 min。取出后冷却至室温，加入50 μL B液（40 mmol/L Tris-HCl缓冲液，pH 8.0），涡旋混匀。随后以3 000 r/min离心5 min，取上清液作为模板进行PCR扩增。实验所用引物均由通用生物（安徽）股份有限公司合成。引物合成序列见表1；PCR扩增体系与程序为采用25 μL标准PCR反应体系进行扩增，体系包含ddH₂O 9.0 μL、上、下游引物各1.0 μL、Taq DNA聚合酶预混液12.5 μL 及鼠尾基因组DNA模板1.5 μL。扩增程序为：95 ℃预变性3 min；随后95 ℃变性 15 s、60 ℃退火 15 s、72 ℃延伸 60 s/kb，共35个循环；最后72 ℃终延伸5 min。使用F1/R1与 F1/R2两组特异性引物分别扩增，F1/R1引物对应敲除型等位基因，预期产物465 bp；F1/R2引物对应野生型等位基因，预期产物 703 bp，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳进行基因型判定。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.06.012.T001表1Il9-/-小鼠基因鉴定引物序列Tab. 1Primer sequences for Il9-/- mice gene identificationPrimer namePrimer sequence （5′- 3′）16198-F1ATCACAGAAGTGTGCTGTCTGG16198-R1CAGAACTTGGTAGTGCCCTGTG16198-F2ATCACAGAAGTGTGCTGTCTGG16198-R2AGTCGGGTTCTGAAATACTAAAGG取100 mL锥形瓶，向瓶中称取1.2 g琼脂糖，溶解在60 mL TAE缓冲溶液中，加热至澄清透明后于琼脂糖溶液中加入10 µL核酸染料，摇匀后倒入模具中凝固，在电泳槽内放入凝固的凝胶。在每孔中加入待测的DNA样品，每个样本各10 µL，其中一个孔中加入5 µL DNA marker。电泳仪调至120 V，电泳40 min。紫外成像系统下观察分析每只小鼠的基因型，截图保存结果。1.4.3小鼠免疫细胞分离固定小鼠并剪去胡须，轻压眼部使眼球充血突出，用弯头镊迅速摘取眼球，将血液收集于1.5 mL离心管中。采血完成后以颈椎脱臼法处死小鼠。将血液与等体积PBS混匀后，缓慢加至等体积小鼠淋巴细胞分离液上液面，以800 r/min 离心30 min，吸取中间白膜层细胞，即获得外周血单个核细胞（peripheral bood mononuclear cell，PBMC）。另取小鼠脾脏和肺组织，置于1.5 mL离心管中备用。脾脏来源PBMC的分离方法与外周血PBMC相同。采用颈椎脱臼法处死小鼠后，将其浸泡于75%乙醇中消毒5 min。获取腹腔巨噬细胞（peritoneal macrophage，PM）时，先剪开小鼠腹部皮肤，暴露腹膜，向腹腔内注入6~8 mL生理盐水，轻轻按摩腹部5 min，随后用注射器回收灌洗液。回收液经1 500 r/min离心5 min，弃上清液即得PM。1.4.4Western blot检测Il9蛋白的表达采用颈椎脱臼法处死小鼠后，取F2代小鼠的肝脏、脾脏、心脏、胸腺组织，剪碎后置于1.5 mL离心管中，提取总蛋白并进行标准浓度定量。定量后的蛋白样品经10% SDS-PAGE电泳分离，随后转印至PVDF膜。用含5%脱脂奶粉的TBST溶液室温封闭PVDF膜2 h，之后分别加入Il9一抗（1∶1 000）和内参β-actin抗体（1∶10 000），于4 ℃孵育过夜。次日，用TBST洗涤膜3次，每次10 min，然后加入山羊抗兔IgG二抗（1∶10 000），室温孵育2 h。再用TBST洗涤3次、PBS洗涤1次，每次10 min。最后通过化学发光成像系统扫描采集图像，并使用ImageJ软件对目标条带进行灰度值分析。1.4.5流式细胞术检测Il9-/-小鼠对免疫系统功能的影响将“1.4.3”项中提取的腹腔PM和外周血及脾脏来源PBMC分别转移至1.5 mL离心管中，按WT与Il9-/-分组。以2 000 r/min 离心5 min收集细胞，经固定破膜处理后，分别按流式抗体说明书推荐比例（1Test/106个细胞）加入F4/80、CD4及CD19抗体，４℃避光孵育30 min。1 500 r/min离心5 min弃上清液后，用适量PBS重悬细胞，经纱网过滤至流式管中，最后采用十色流式细胞仪进行检测分析。1.5统计学处理采用GraphPad Prism 10.0软件进行数据分析及图表的制作，计量数据采用x¯±s表示，组间比较使用独立样本t检验，以P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1小鼠的繁育情况F1代母鼠成功繁育出F2代幼鼠，母鼠妊娠期稳定在19~21 d，每胎产幼鼠数量3~8只，且幼鼠成活率超过90%。本次实验对F2代子代小鼠进行了性别鉴定与统计分析，共获得子代小鼠15只，其中雄性个体7只，雌性个体8只，雌雄比例接近1∶1（7∶8）。2.2小鼠基因型鉴定结果图1中显示了F2代小鼠的基因型鉴定结果，1~15号小鼠在引物组1中仅出现一条分子量为465 bp的条带，证实其皆为Il9-/-纯合子小鼠，结果明确表明已成功获得了稳定的纯合基因敲除小鼠种群。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.06.012.F001图1Il9-/-小鼠基因鉴定结果Fig.1Results of the Il9-/- mice gene identificationA： PCR results obtained with primer set 1； B： PCR results obtained with primer set 2； 1-15： Different mouse numbers are represented.2.3基因敲除小鼠IL-9蛋白表达情况为验证PCR鉴定结果，采用Western blot方法检测野生型和Il9纯合子小鼠心、肝、肾、肺和脾脏中IL-9蛋白表达。结果显示，野生型小鼠脏器中表达IL-9蛋白，而纯合子小鼠在脏器中几乎无IL-9表达，与PCR鉴定结果吻合。这一结果证实了Il9-/-纯合小鼠模型的构建成功，为后续研究Il9功能提供了可靠的动物模型（图2）。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.06.012.F002图2IL-9在WT小鼠和Il9-/-小鼠不同免疫细胞和组织中的表达水平Fig. 2The expression levels of IL-9 in different immune cells and issues of WT mice and Il9-/-miceA： Expression of IL-9 protein in heart； B： Expression of IL-9 protein in lung； C： Expression of IL-9 protein in liver； D： Expression of IL-9 protein in spleen； E： Expression of IL-9 protein in kidney； ***P0.001， ****P0.000 1 vs WT mice.2.4Il9基因敲除小鼠对免疫系统功能的影响为了探讨Il9基因敲除对小鼠免疫系统功能的影响，采用流式细胞术检测了Il9野生型和Il9纯合子小鼠腹腔PM及外周血、脾脏来源CD4+ T细胞亚群、CD19+ B细胞亚群的变化。结果显示，与Il9野生型小鼠相比，Il9纯合子小鼠外周血及脾脏PBMC中CD4+ T细胞、CD19+ B细胞未见显著变化（图3A、3B），且在Il9纯合子小鼠的腹腔PM中，F4/80+细胞的比例未见显著变化（图3C）。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.06.012.F0033讨论本研究成功构建了C57BL/6N背景的Il9基因敲除小鼠（Il9-/-），并建立了一套高效、稳定的基因型鉴定体系。通过PCR与Western blot双重验证，确认Il9基因在纯合子小鼠的主要组织和免疫细胞中均被完全敲除，模型繁育稳定，遗传背景纯净。这为后续研究Il9在免疫系统发育、炎症反应及免疫相关疾病中的作用提供了可靠的动物基础。Il9是一种由Th9细胞、肥大细胞等分泌的多效性细胞因子，能通过与Il9受体结合激活Janus激酶/信号转导与转录激活因子（JAK/STAT）信号通路，从而调控多种免疫细胞的增殖、分化及效应功能［1–2，4–5］。其在免疫系统中兼具促炎与免疫调节的双重作用，参与多种疾病的发生发展。已有研究［3–6］表明，Il9在哮喘、特应性皮炎等过敏性疾病中促进肥大细胞和嗜酸性粒细胞活化，加重气道炎症；在肿瘤免疫中则具有复杂的双向调节效应，既可增强抗肿瘤免疫反应，也可能在某些环境下促进肿瘤免疫逃逸。值得关注的是，Il9在自身免疫性疾病中的作用近年来逐渐受到重视。Il9通过促进 Th17细胞增殖、抑制Treg细胞功能及增强B细胞活化，可导致免疫耐受破坏，从而参与类风湿关节炎、系统性红斑狼疮及多发性硬化等疾病的病理进程［7–9］。本课题组前期研究［10］已显示，PU.1-Il9轴在类风湿关节炎的炎症放大与关节损伤中发挥关键调控作用，其异常激活可加剧滑膜炎症浸润与软骨破坏。Il9缺失小鼠为研究其在自身免疫病发病机制中的具体作用提供了关键工具。未来可在类风湿关节炎或实验性自身免疫性脑脊髓炎模型中，系统观察Il9缺失后免疫细胞分化与炎症反应的变化，进一步验证PU.1-Il9轴的调控功能，以揭示Il9介导的自身免疫反应调控机制 ［10–12］。在本研究的初步免疫学检测中，Il9基因敲除对外周血与脾脏中CD4+T细胞、CD19+B细胞比例及腹腔巨噬细胞中F4/80+细胞比例影响较小（均P0.05）。这提示Il9在稳态条件下对免疫细胞比例或数量的影响有限，其主要作用可能体现在特定免疫激活或病理状态中。已有文献［13–15］显示，Il9信号通路可在炎症或自身免疫反应中被强烈诱导，调节Th9、Th17及B细胞功能，从而影响疾病严重程度［16］。因此，Il9缺失小鼠在健康状态下未出现显著免疫学差异，但在疾病模型中可能呈现出明显的免疫反应变化。综上所述，本研究构建的Il9基因敲除小鼠模型遗传稳定、表型明确，成功验证了其在免疫系统稳态下的安全性与可用性。该模型不仅为阐明Il9在过敏性疾病、感染及肿瘤免疫中的作用提供了基础工具，更为深入研究其在自身免疫性疾病发病机制中的调控作用奠定了重要实验基础。未来结合炎症模型和自身免疫疾病模型研究Il9信号通路的动态变化，有望为开发以Il9/Il9R为靶点的免疫调节策略提供新的理论依据。