血管通透性指物质透过血管壁的能力，是维持血管、组织和器官之间物质交换的选择性机制［1］。血管通透性增加可致疾病急剧恶化［1］，如炎症引起肺水肿［2］。由于血管内皮细胞在控制血管通透性方面至关重要，故探究调控内皮细胞通透性相关蛋白，研究其作用机制，对探究疾病的发生发展具有重要意义。CD151是四跨膜蛋白超家族（transmembrane 4 superfamily，TM4SF）重要成员，在内皮细胞中丰度极高，通过囊泡运输调控膜蛋白分子内化［3］。研究［4］表明，囊泡运输与多种疾病密切相关，例如，癌细胞通过分泌细胞外囊泡破坏血脑屏障，促进多种脑部疾病的进展。因此，CD151可能成为多种血管相关疾病的潜在治疗靶点。已知CD151在其羧基端胞内结构域中含有YXXφ囊泡运输基序，该基序可调控囊泡的内化再循环及运输过程［5–7］，推测CD151可能通过YXXφ基序影响相关蛋白的内化与运输，从而调控生成血管的稳定性。该研究通过观察CD151敲除对小鼠皮肤血管内皮通透性的影响，探究CD151 YXXφ基序点突变体通过囊泡内化再循环调控血管通透性的机制，为血管相关疾病的发生发展及治疗提供理论参考依据。1材料与方法1.1材料1.1.1实验动物本研究使用的7至12周龄CD151全身敲除雄性小鼠12只（体质量20~25 g）构建于中国医学科学院实验动物研究所，背景为C57/BL6 种系。基因分型采用小鼠组织直接PCR试剂盒 ［翌圣生物科技（上海）股份有限公司；货号：10185ES70］，依照说明书方案从尾尖提取基因组DNA，并以同龄、同性别野生型同窝小鼠作为对照。所有小鼠饲养于同济医学院实验动物中心SPF级环境内，环境条件为：12 h光照/黑暗循环，温度 （22±2） ℃，湿度40%~50%。动物实验方案经同济医学院机构动物研究委员会批准（IACUC编号：3392），并严格遵守3R原则执行。动物合格证许可证号：SCXK（苏）2025-0008。1.1.2细胞与试剂人内皮细胞系EA.hy926（ATCC，货号：CRL-2922）。DMEM培养基（货号：C11995500BT）、胎牛血清（fetalbovine serum，FBS，货号：10270-106）（美国Gibco公司）。Lipofectamine 2000试剂（美国赛默飞世尔科技公司，货号：11668019）。CD151（货号：66567-1-Ig）和GAPDH抗体（货号：60004-1-Ig）（美国Proteintech公司）。抗血管内皮钙黏蛋白（anti-VE-cadherin） 抗体（美国Cell Signaling Technology公司，货号：2500S）。用于免疫荧光（immunofluorescence，IF）染色的抗CD151抗体（美国Abcam公司，货号：ab33315）。血管内皮生长因子A165（vascular endothelial growth factor A165，VEGF-A165）（人）（货号：AF-293-NA）和血管内皮生长因子A164（vascular endothelial growth factor A164，VEGF-A164）（小鼠）（货号：AF-493-NA）（美国R&D Systems公司）。重组CD151腺病毒（Adeno-CD151， 1.02×1011 PFU/mL）、空腺病毒（Adeno-CMV-3*flag-tagged）（上海和元生物技术有限公司）。Sulfo-NHS-SS-Biotin（美国ApexBio Technology公司，货号： A8005）。链霉亲和素磁珠（美国MedChemexpress生物科技公司，货号：HY-K0208）。异硫氰酸荧光素标记的葡聚糖（fluorescein isothiocyanate-labeled dextran，FITC-dextran）工作液（货号： 46945）、伊兰染料（货号：E2129）、脂多糖（货号：L2630）和所有其他化学物质和试剂（美国Sigma-Aldrich公司）。1.1.3实验设备CO2恒温培养箱（德国Heraeus Holding GmbH公司，型号：MCP-120）、低温高速离心机（美国Beckman Coulter公司，型号：Allegra V-15R）、常温高速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司，型号：H1850）、垂直电泳转膜系统（美国Bio-Rad公司，型号：XU-Mini4）、化学发光成像系统（上海天能科技有限公司，型号：LJ-GI NZ）、多模式酶标仪（美国Bio-Tek仪器股份有限公司，型号：Synergy 2）、96孔快速热循环仪（美国Applied Biosystems公司，型号：VeritiTM 96-Well Fast Thermal Cycler）、7900HT FAST real-time PCR system（美国Life Technologies Corporation公司，型号：Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR System）、荧光显微镜（德国Carl Zeiss AG公司，型号：Axio Imager A2）、超微量分光光度计（北京凯奥科技发展有限公司，型号：KAIAO K5800）、倒置荧光显微镜（日本Olympus Corporation公司，型号：IX71）、暗箱式紫外分析仪（上海路阳仪器有限公司，型号：LUV-270）。1.2方法1.2.1分组与处理将小鼠分为WT（野生型）组和KO（CD151基因敲除）组，每组6只。每只小鼠两侧皮肤分别注射PBS和VEGF-A，将实验小鼠分为2组，根据每只小鼠不同侧用药再划分组别，分为：WT-PBS组、WT-VEGF-A组、KO-PBS组、KO-VEGF-A组，每组3只。对于腹背部皮肤：暴露小鼠一侧腹背部，左手固定皮肤，右手持针与皮肤成10°~15°上挑状进针，注射上下两点VEGF（每点VEGF剂量50 ng，体积50 μL），注射完毕旋转状缓慢退针；另一侧对称部位注射同体积无菌PBS作为对照。对于耳部皮肤：采用同样的方法，于一侧耳后注射VEGF（剂量25 ng，体积为10 μL），对侧耳后注入同体积PBS。1.2.2Miles实验采用改良的Miles实验检测WT和CD151敲除的C57/BL6小鼠背部皮肤和耳后血管通透性。在小鼠腹背部或耳后注射VEGF-A或PBS后，经尾静脉将100 μL 浓度为1%的伊兰染料注射到小鼠体内。30 min后，脊髓脱臼法处死小鼠。固定小鼠，用镊子提起后剪开其皮肤，钝性分离皮肤及组织，拍照记录染料从血管内漏出的情况。将每点注射部位的皮肤块及2只耳朵分别完整切下，提取组织中染料并测量染料浓度，在620 nm处测定吸光度值，定量染料浓度，根据标准曲线计算血浆中的染料浓度，以评价小鼠背部及耳后血管通透性。1.2.3细胞培养与感染人内皮细胞系EA.hy926用DMEM完全培养基（含10% FBS，100 U/mL青-链霉素双抗），于37 ℃恒温，95%空气、5%CO2环境培养。每周传代2次，间隔2~3 d换液。在腺病毒载体介导的基因转导中，用过表达-控制载体或过表达-靶蛋白载体感染细胞48 h。1.2.4蛋白质结构建模将CD151蛋白质序列上传至服务器后，基于已知结构白细胞表面抗原CD5（3 PDB ID 6WVG）的晶体结构，同源建模得到预测的CD151结构。CD151蛋白结构预测由SWISS-MODEL（http：//swissmodel.expasy.org//SWIS S-MODEL.html）完成。YXXφ基序的点突变及可视化使用PyMOL（http//www.pymol.org）完成。1.2.5内皮单层通透性测定使用腺病毒（adenovirus， AdV）感染EA. hy926细胞，将感染后的细胞分为：① con组；② Ad-con组；③ Ad-CD151组；④ Ad-YALA组；⑤ con+VEGF组；⑥ Ad-con+VEGF组；⑦ Ad-CD151+VEGF组；⑧ Ad-YALA+VEGF组。将细胞在完全培养基中继续常规培养48 h（期间无其他特殊处理）后，用胰酶消化下来。轻柔吹散细胞、计数，调整细胞数目，按照每上室200 μL细胞悬液（含1×104个细胞）接种，下室每孔加入500 μL培养基，继续培养至形成内皮细胞单层。内皮单层形成后，将1 mg/mL的FITC-dextran置于上室中，并用50 ng/mL的VEGF-A刺激细胞15、30、60和120 min（其中⑤～⑧组加VEGF-A 刺激，①～④组不加VEGF-A，作为基础对照）。将下室的培养基充分混合，置于黑色96孔不透明板上进行测量，在Synergy 2多模式酶标仪（Bio-Tek）上读取相应的荧光值。1.2.6RT-qPCR提取EA.hy926细胞总RNA，逆转录获得cDNA。RT-qPCR采用SYBR Green法，使用7900HT FAST实时PCR系统（Life Technologies）进行检测。以GAPDH作为校正内参，采用2-ΔΔCT方法计算VE-cadherin的mRNA相对表达量，引物序列见表1。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.06.005.T001表1引物序列Tab.1Primer sequencePrimer namePrimer sequence （5′-3′）GAPDHF： ATGGGGAAGGTGAAGGTCGR： GGGGTCATTGATGGCAACAATAVE-cadherinF： GAAGCCTCTGATTGGCACAGTGR： TTTTGTGACTCGGAAGAACTGGC1.2.7免疫荧光染色取内皮细胞在0.1%明胶涂层玻璃底24孔板上生长，按需分组（con组、Ad-con组、Ad-YALA组、Ad-YALA+VEGF组）干预细胞后，吸弃培养基，用PBS洗涤细胞3次、4%多聚甲醛固定15 min，沿孔壁加入500 μL 0.1% Triton X-100，5 min后清洗，用5%正常驴血清封闭30 min。加入一抗（兔抗 VE-cadherin 单克隆抗体，按稀释比1∶200稀释于封闭液中）工作液在4 ℃下孵育过夜，用PBS洗涤3次，并与稀释的Alexa Fluor®偶联二抗（稀释比1∶1 000）在室温下孵育1 h。采用DAPI染色。使用Zeiss Axio Imager荧光显微镜采集图像，Zen软件（Zen 3.0 blue edition）对采集到的图像进行处理。对于 Factin 染色，在二抗孵育并洗涤后，加入鬼笔环肽工作液（Alexa FluoTM 568标记的鬼笔环肽，美国Thermo Fisher公司，货号：A12380，用PBS按1∶200稀释），室温避光孵育30 min。然后用PBS洗涤3次，再进行DAPI染色。1.2.8生物素标记膜蛋白内化实验将上述各组细胞（con组、Ad-con组、Ad-CD151组、Ad-YALA组）取出置于冰上，与sulfo-NHS-SS-biotin工作液在4 ℃摇床孵育15 min，以最大限度地标记细胞表面蛋白。加入终止液充分清洗细胞3次，彻底洗去未反应生物素。已标记细胞在37 ℃预热的内化缓冲液中孵育不同时间，用冰NT缓冲液快速洗涤以停止内吞作用。为了去除细胞表面结合的生物素，将细胞与新鲜洗脱液（NT缓冲液配制的50 mmol/L TCEP溶液）在冰上孵育15 min，重复3次。所有细胞板用PBS2+洗涤后，在含有蛋白酶抑制剂IP裂解液中裂解细胞。生物素化蛋白用链霉亲和素磁珠沉淀，电泳后采用Western blot检测目的蛋白。1.2.9Western blot用IP裂解缓冲液裂解细胞，BCA法测定蛋白浓度。蛋白样品用SDS-PAGE分离，转移到PVDF膜上，用5% BSA在TBS-T中室温封闭1 h。然后将膜与一抗（小鼠抗CD151单克隆抗体，每孔70 µL，保证覆盖爬片，且不会完全蒸发，工作浓度0.2 µg/mL，1∶1 000稀释于封闭液中）在4 ℃下孵育过夜。与过氧化物酶结合的二抗［Alexa Fluor 488 标记的山羊抗小鼠 IgG（H+L），工作浓度0.2 µg/mL，稀释比1∶1 000，稀释于PBS中］孵育2 h后，使用Western Bright ECL HRP发光试剂盒在化学发光成像系统（Tanon Science and Technology）上显影成像。通过ImageJ软件对Western blot条带进行半定量分析。1.3统计学处理采用GraphPad Prism（v8.0）软件进行统计分析，首先对数据进行正态性检验（Shapiro-Wilk检验）和方差齐性检验（Levene检验），所有正态分布数据均采用均数±标准误表示，非正态分布数据采用中位数（四分位数间距）表示。若数据满足正态性和方差齐性，多组间比较采用单因素方差分析或重复测量方差分析，分析前进行Mauchly球形检验，若违反球形假设，则采用Greenhouse-Geisser校正后的结果。方差分析后采用Bonferroni法进行两两比较。若数据不满足正态性或方差齐性，多组间比较采用Kruskal-Wallis H检验，事后两两比较采用Dunnett's t检验。P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1小鼠基因型鉴定结果使用基因编辑技术构建CD151全身敲除小鼠，鼠尾鉴定（图1A）结果显示野生型（WT）小鼠在958 ku处出现特异性扩增条带，表明其 CD151基因正常表达，CD151敲除（KO）小鼠则未出现该特异性条带，表明其 CD151基因被成功全身性敲除。Western blot（图1B）结果显示CD151的蛋白表达显著下调，差异具有统计学意义（t=18.5，P0.000 1）。这表明CD151全身敲除小鼠构建成功。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.06.005.F001图1小鼠基因型鉴定结果Fig.1Genotyping results of miceA： Mouse tail genotyping assay for CD151 expression； B： Western blot analysis of CD151 protein expression levels in mouse tissues （n=6）； **** P0.000 1 vs WT group.2.2CD151缺失导致皮肤血管通透性升高通过改良血管Miles实验检测小鼠背部及耳后血管通透性。背部皮肤血管Miles实验结果显示，在非刺激条件下，WT组与CD151 KO组小鼠背部皮肤血管的通透性无显著性差异。然而，给予VEGF诱导刺激后，与WT组小鼠相比，KO组小鼠背部皮肤血管的通透性明显增加（t=2.85，P0.05）（图2A）；耳后皮肤血管Miles实验结果表明KO组小鼠耳后皮肤血管的通透性较WT组明显增加（t=3.84，P0.01）（图2B）。以上实验结果提示在VEGF诱导刺激下，CD151缺失导致小鼠皮肤血管通透性明显增加。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.06.005.F002图2CD151缺失对小鼠背部、耳后血管渗透性影响Fig.2The effects of CD151 deficiency on vascular permeability in the back and behind the ears of miceA： Comparison of Evans blue dye extravasation in the dorsal skin of mice between the two groups （n=6）； B： Comparison of Evans blue dye extravasation in the postauricular skin of mice between the two groups （n=6）； #P0.05， ## P0.01 vs WT-VEGF-A group.2.3构建CD151 YXXφ基序点突变体YALA在体外研究中，构建CD151突变体YALA，其结构如图3A所示。运用包装的腺病毒进行内皮细胞转染，Western blot检测各组细胞CD151蛋白表达情况，结果表明，Ad-CD151和Ad-YALA转染促进CD151蛋白高表达（t=18.5，P0.000 1），且突变体YALA不影响CD151蛋白的高表达（t=0.85，P0.05）（图3B）。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.06.005.F003图3CD151 YXXφ基序点突变体YALA空间结构Fig.3The spatial structure of the CD151 YXXφ motif mutant YALAA： Schematic diagram of the spatial structure of the CD151 YXXφ motif point mutant YALA； B： Western blot analysis of CD151 expression levels （n=6）； ****P0.000 1 vs Ad-con group.2.4CD151 YXXφ基序点突变导致体外血管通透性升高取腺病毒干预后的各组内皮细胞形成细胞单层，分别观察基础条件及VEGF-A刺激条件下对内皮细胞对FITC-dextran的通透性，检测各组别内皮细胞层屏障功能。结果显示，在给予VEGF诱导刺激60 min和120 min后，Ad-YALA+VEGF组对FITC-dextran的通透性高于对照组（t=3.24、3.78，均P0.05）（图4）。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.06.005.F004图4CD151突变体YALA过表达对内皮细胞层通透性的影响Fig.4The effects of overexpression of CD151 mutant YALA on the permeability of the endothelial cell layerA： Comparison of the mean fluorescence intensity of each group at different time points under baseline conditions （n=6）； B： Comparison of the mean fluorescence intensity of each group at different time points under VEGF-A stimulation conditions （n=6）； *P0.05 vs Ad-con+VEGF group.2.5CD151 YXXφ基序点突变影响VE-cadherin的分布由于VE-cadherin是最重要的黏附连接蛋白，其所参与的囊泡运输在维持血管稳定性方面发挥重要作用，故探究CD151中YXXφ基序对VE-cadherin分布的影响。Western blot结果显示（图5A），CD151突变体YALA组内皮细胞中VE-cadherin蛋白表达与对照组内皮细胞无明显差异。实时定量PCR结果显示（图5B），在mRNA 水平上，CD151突变体YALA组内皮细胞，相较对照组内皮细胞，VE-cadherin的表达有下降趋势，但差异无统计学意义。免疫荧光染色检测显示，在给予VEGF诱导刺激后，各组细胞层上的VE-cadherin均出现毛刺状分布，局部有小的缺损。其中，CD151突变体YALA组较对照组损伤更重，甚至出现较大范围的缺失，而Ad-CD151组缺损较轻，呈现出保护效应（图5C）。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.06.005.F005图5CD151突变体YALA过表达对VE-cadherin表达的影响Fig.5The effects of overexpression of CD151 mutant YALA on the expression of VE-cadherinA： Comparison of VE-cadherin protein expression among groups； B： Comparison of VE-cadherin mRNA expression levels among groups； C： Immunofluorescence images of VE-cadherin ×600.2.6VE-cadherin的内化受CD151 YXXφ基序点突变调控免疫荧光染色检测结果显示，在CD151突变体 YALA组（Ad-YALA组）中，CD151蛋白相比于对照组（con 组、Ad-con 组）更多分布于内皮细胞周边，表明内化活动减少（图6A）。且CD151突变体转染明显降低了CD151（红色）和VE-cadherin（绿色）在核周区域的共定位，表明VE-cadherin的运输被破坏（图6B，白色箭头指示 CD151 与 VE-cadherin 的共定位信号）。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.06.005.F006图6CD151突变体YALA对CD151在内皮细胞的分布及CD151与VE-cadherin在核周共定位的影响Fig.6The effects of CD151 mutant YALA on the distribution of CD151 in endothelial cells and the co-localization of CD151 and VE-cadherin at the nuclear peripheryA： Immunofluorescence image of CD151 ×600； B： Immunofluorescence image of CD151 and VE-cadherin co-localization ×1 200.2.7CD151 YXXφ基序点突变影响VE-cadherin的内吞过程通过细胞表面生物素化实验，定量比较VE-cadherin的内吞率，结果显示，与对照组相比，CD151突变组在5、10和15 min内化VE-cadherin的量减少（图7）。以上实验结果表明，YXXφ结构调控VE-cadherin内化活动，CD151突变体YALA对VE-cadherin分布的影响与调控其内化活动有关。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.06.005.F007图7Western blot检测CD151突变体YALA对VE-cadherin内吞率的影响Fig.7The effects of CD151 mutant YALA on the endocytosis rate of VE-cadherin detected by Western blot2.8CD151对内皮细胞骨架张力的调节依赖于其结构中的YXXφ基序通过细胞免疫荧光对鬼笔环肽标记F-actin对VE-cadherin所锚定的细胞骨架进行检测，结果显示CD151突变体YALA组细胞内出现粗大放射状的张力丝，提示因细胞骨架收缩所致的高张力状态，而在对照细胞中，细胞骨架则呈纤细均匀的皮质肌动蛋白束（图8）。以上实验结果说明CD151突变体 YALA使内皮细胞骨架收缩，即 CD151对内皮细胞骨架张力的调节依赖于其结构中的 YXXφ基序。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.06.005.F008图8CD151突变体YALA对内皮细胞骨架张力的调节Fig.8The regulation of endothelial cell cytoskeletal tension by the CD151 mutant YALAImmunofluorescence staining of endothelial cells ×600.3讨论内皮细胞在血管内壁上形成连续的单层，调节各种血管功能，如炎症、血管生成、止血和血管舒张［8］。内皮功能障碍和通透性增加在许多疾病进展中起重要作用，如动脉粥样硬化［9］。在生理条件下，微血管通透性受到严格控制，但各种刺激（如缺氧、炎症等）会导致血管通透性短暂上调，通透性丧失又会导致各种病理状况，如缺氧、慢性炎症、肿瘤血管生成和动脉粥样硬化［10–11］。本研究通过构建CD151敲除小鼠，观察CD151缺失对小鼠皮肤血管通透性的影响。Miles实验结果表明，CD151敲除组小鼠背部及耳后皮肤血管中染料渗出较对照组明显增加。通过构建CD151敲低内皮细胞，检测CD151对单层内皮细胞通透性的影响，实验结果表明，CD151敲低可显著增加VEGF-A诱导的内皮细胞单层的通透性。以上实验结果说明，CD151表达降低可导致内皮细胞通透性上升。膜受体与其配体结合，通过内吞、囊泡运输和胞吐作用返回细胞表面的过程，称为内化再循环［12］，该过程对维持血管稳定性和内皮屏障功能至关重要［13］。既往研究［14–15］表明，CD151分子结构中的YXXφ基序调控囊泡的内化再循环过程，且该基序点突变（245位的酪氨酸和248位的亮氨酸均突变为丙氨酸，即 Y→A 和 L→A）会破坏CD151的内化再循环过程，导致其因内化受阻而异常分布在细胞周边，这证实了CD151通过YXXφ基序调控囊泡内化活动，但其下游机制仍待进一步研究。本研究为探究CD151 YXXφ基序点突变体影响血管通透性的机制，构建了CD151 YXXφ基序点突变体YALA并转入内皮细胞。Miles实验结果表明，在给予VEGF诱导刺激60 min和120 min后，过表达突变体YALA组对FITC-dextran的通透性相较对照组显著升高。由于CD151介导内皮细胞的细胞间黏附与细胞-胞外基质黏附，在维持内皮细胞血管样结构和血管稳定性中起重要作用［16–17］，故进一步探究CD151是否影响参与内皮细胞囊泡运输的黏附连接蛋白VE-cadherin的表达及相关功能。免疫荧光结果显示，过表达突变体YALA影响VE-cadherin在细胞膜上的表达。且突变体YALA抑制CD151的内化活动，影响CD151和VE-cadherin在核周区域的共定位。细胞表面生物素化实验结果表明，过表达突变体YALA后，内皮细胞在5、10和15 min内化VE-cadherin的量显著减少。上述实验结果表明，CD151 YXXφ基序点突变体YALA影响CD151及VE-cadherin的分布，破坏VE-cadherin的运输。此外，在黏附连接结构中，VE-cadherin通过其他蛋白复合体锚定在细胞骨架上，骨架的动态重塑影响细胞间与细胞-胞外基质的黏附连接，这与血管稳态密切相关［17–20］。为进一步探究CD151突变体YALA对VE-cadherin所锚定的细胞骨架的影响，本研究使用鬼笔环肽标记F-actin对其进行检测，实验结果表明，CD151突变体 YALA使内皮细胞骨架收缩，即CD151对内皮细胞骨架张力的调节，依赖于其结构中的YXXφ基序。上述实验结果表明，CD151突变体YALA抑制细胞骨架重塑，可能削弱血管内皮细胞黏附连接功能，进而破坏血管稳态。本研究揭示了CD151 YXXφ基序点突变体调控血管通透性的潜在途径和机制，但存在一定局限性。CD151中是否有其他可调控囊泡内化再循环的结构，其是否还影响除VE-cadherin之外的其他膜蛋白的囊泡内化再循环以调控血管通透性，均有待进一步探索。综上所述，本研究从VEGF-A诱导的CD151敲除小鼠皮肤血管渗透性的变化切入，证实了CD151 YXXφ基序点突变体YALA通过调控VE-cadherin的囊泡内化再循环，进而调控血管通透性，为血管稳态的研究提供了新方向。