2026 - 03 - 10 接收胃癌是全球发病率第5、病死率第5的常见恶性肿瘤［1］。在中国，胃癌的发病率位居所有恶性肿瘤的第5位，而病死率则高居第3位［2］。胃癌目前主要通过影像学筛查、内镜筛查以及血清肿瘤标志物检测进行早期筛查［3］，临床治疗则以手术切除联合放化疗为主［4］。随着医学研究的进展，以免疫检查点抑制剂为代表的免疫治疗已成为胃癌治疗的重要策略［5］。因此，深入探究胃癌的发病机制具有重要意义。Disco相互作用蛋白2同源物B（disco interacting protein 2 homolog B， DIP2B），定位于人类12号染色体q13.12区域，参与调控多种细胞生物学过程，包括细胞骨架重塑、细胞迁移和分化等［6–7］。在癌症研究中，DIP2B参与调控多种肿瘤的发生与发展，并可作为生物标志物监测肿瘤进展［8］。但其在胃癌中的具体作用机制尚未明确，仍有待进一步研究以推动其临床转化。该研究通过生物信息学分析和体外细胞实验，探究DIP2B在胃癌细胞增殖、迁移和侵袭中的作用，旨在为胃癌的靶向治疗提供新的分子靶点和实验依据。1材料与方法1.1材料人胃黏膜细胞GES-1，胃癌细胞AGS、SNU668、MKN28和MKN45均购自中科院上海细胞库。实验试剂：0.25%胰蛋白酶、RPMI-1640培养基、胎牛血清、逆转录试剂盒、β-actin抗体、DIP2B抗体（美国赛默飞世尔科技公司，货号：25200114、11875093、10099141C、K1691、MA5-15739、PA5-22089）；GenMuteTM转染试剂（美国思科生物有限公司，货号：SL100568）；结晶紫染料（上海碧云天生物技术股份有限公司，货号：C0121-100ml）；细胞培养瓶、6孔培养板、Transwell小室、基质胶（美国康宁公司，货号：430639、353224、3428、356234）；无血清细胞冻存液（苏州新赛美生物科技有限公司，货号：C40100）；QuantiNova SYBR Green PCR Kit（德国QIAGEN公司，货号：208052）；qPCR引物购自上海生工生物工程股份有限公司；Annexin V-FITC / PI双染细胞凋亡检测试剂盒、细胞周期检测试剂盒（PI）（上海贝博生物，货号：BB-4101、BB-4104）；二抗：Anti-rabbit IgG（HRP-linked Antibody）、Anti-mouse IgG（HRP-linked Antibody）（美国Cell Signaling Technology公司，货号：7074、7076）。主要实验仪器：二氧化碳细胞培养箱、冷冻离心机、超微量紫外分光光度计（美国赛默飞世尔科技公司，型号：Forma 3140、ST16R、Nanodrop 2000）；梯度PCR仪、实时荧光定量PCR仪、凝胶成像系统、垂直电泳系统（包含通用电源）（美国Bio-rad公司，型号：T100、CFX Connect、ChemiDoc、PowerPac Basic）；流式细胞仪（美国贝克曼库尔特有限公司，型号：CytoFlex B53010）；倒置相差显微镜成像仪（日本尼康公司，型号：EOL UPSET Ts2）；细胞计数仪（美国丹诺尔公司，型号：Celldrop BF）；实时活细胞分析仪（美国安捷伦科技有限公司，型号：xCELLigence DP）。1.2方法1.2.1生物信息学分析通过GEPIA数据库（http：//gepia.cancer-pku.cn/index.html）、TIMER2.0数据库（http：//timer.cistrome.org/）分析胃癌患者组织中DIP2B的表达，预测胃癌患者与DIP2B的生存相关性。基于TCGA转录组数据（来源：GDC数据库，https：//portal.gdc.cancer.gov/），以DIP2B基因表达的中位值为阈值，将样本分为高表达组和低表达组。随后，采用cluster Profiler包（v4.8.1）进行基因集富集分析（gene set enrichment analysis， GSEA），揭示DIP2B相关基因集的调控特征。所有分析均在R语言环境（v4.3.1）下完成，并采用FDR校正（P0.05）确保结果的统计学显著性。1.2.2细胞培养及转染细胞培养采用含10%胎牛血清FBS和1%青霉素-链霉素双抗的RPMI-1640完全培养基，置于37 ℃、5% CO2的恒温恒湿培养箱中常规培养。实验细胞分为两组，一组为DIP2B低表达细胞组，另一组为阴性对照（negative control， NC）组，为构建DIP2B低表达细胞模型，选用广州锐博生物公司合成的特异性siRNA，siRNA序列见表1，并采用GenMuteTM转染试剂，按照说明书操作流程进行转染实验。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.06.003.T001表1siRNA序列Tab.1The sequence of siRNANameSequence（5′-3′）siDIP2B#1GAACGATATCGATCAGATAsiDIP2B#2GGTTAGTGGTCGAAGACAT1.2.3RT-qPCR使用TRIzol试剂提取细胞中总RNA，并纯化。使用 Thermo ScientifictmTM RevertAidTM RT试剂盒进行RNA逆转录。在获得cDNA产物后，使用 SYBR Green试剂盒进行qPCR。引物序列见表2。RT-qPCR数据通过2-ΔΔCT方法计算相对基因表达差异。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.06.003.T002表2PCR引物序列Tab.2The sequence of real-time PCR primersGene nameSequenceDIP2BF： 5'-TTGAGTTAATCGCCGCCTTCTATGG-3'R： 5'-GCCGTGAGGTTCTGAGCATGTG-3'GAPDHF： 5'-ACACCCACTCCTCCACCTTTG-3'R：5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3'1.2.4Western blot使用RIPA裂解液提取细胞中总蛋白后，通过BCA法进行蛋白定量检测。使用10% SDS-PAGE凝胶进行电泳，随后进行转膜，封闭，一抗（β-actin，DIP2B）（1∶1 000）4 ℃孵育过夜、二抗（Anti-rabbit IgG、Anti-mouse IgG）（1∶2 000）室温孵育2 h，最后使用ChemiDoc触摸成像系统进行曝光。ImageJ 软件检测蛋白灰度值。1.2.5克隆形成实验取对数生长期细胞，以每孔1 000个细胞的密度接种于6孔板中，每组设3个复孔，补充完全培养基至2 mL/孔，采用十字法轻柔混匀后置于37 ℃、5% CO2培养箱中常规培养。每日观察细胞生长状态，当单个克隆集落中细胞数大于50个或培养达2周时终止培养。弃去培养基，PBS洗涤后4%多聚甲醛固定，结晶紫染色，晾干后拍照并计数克隆集落个数。1.2.6实时无标记动态细胞分析（real-time cellular analysis， RTCA）采用xCELLigence RTCA系统实时监测细胞增殖动力学变化。将500个细胞/孔接种于E-Plate检测板中，置于xCELLigence DP仪器上，37 ℃、5% CO2条件下连续培养80 h。系统自动记录细胞指数变化曲线。1.2.7细胞迁移及侵袭实验细胞迁移实验：取对数生长期细胞，经胰酶消化后，1 000 r/min离心5 min收集细胞，用无血清RPMI-1640培养基重悬细胞。将200 μL细胞悬液（含5×104个细胞）加入Transwell上室（8 μm孔径），下室加入600 μL含10%胎牛血清的完全培养基。37 ℃培养48 h后，4%多聚甲醛固定，0.1%结晶紫染色，于倒置显微镜下拍照计数。细胞侵袭实验：提前将Matrigel基质胶用无血清培养基按1∶8比例稀释，每孔加入100 μL铺于Transwell上室，37 ℃孵育4 h形成基质胶层。后续细胞处理同细胞迁移实验，培养48 h后固定、染色并计数。1.2.8细胞凋亡检测收集各组细胞，使用PBS溶液清洗细胞3次，调整细胞数为1×105个/管，向其中加入400 μL 1×Annexin V/FITC结合液和5 μL Annexin V/FITC，轻柔混匀后避光孵育15 min，再向其中加入5 μL PI染液，孵育5 min，随后使用流式细胞仪检测细胞凋亡水平。1.2.9细胞周期检测收集待测细胞，使用PBS溶液清洗细胞3次，调整细胞数为1×106个/管，向细胞中加入75%乙醇固定细胞过夜，随后1 000 r/min离心5 min弃去乙醇并加入500 μL PBS重悬细胞，加入Rnase A溶液20 μL，37 ℃水浴30 min后，以1 000 r/min速度离心5 min去除溶液，再加入400 μL PI染液重悬细胞，轻轻混匀后4 ℃避光孵育0.5~1 h，随后使用流式细胞仪检测细胞周期。1.3统计学处理实验数据以均值±标准差表示，采用SPSS 26.0和GraphPad Prism 9.0进行统计分析。两组数据之间比较使用t检验来评估是否具有统计学差异。采用单因素方差分析检验多组间的差异性。双侧P0.05 为差异有统计学意义，所有实验均独立重复3次。2结果2.1DIP2B在胃癌中高表达基于TIMER 2.0数据库的生物信息学分析显示，DIP2B在包括胃癌在内的多种恶性肿瘤组织中呈现显著高表达（图1A）。为验证这一发现，本研究从TCGA数据库中获取胃癌样本数据，分析发现，与正常胃黏膜组织相比，胃癌组织中DIP2B mRNA表达水平显著升高（P0.05，图1B）。通过GEPIA数据库分析发现，DIP2B高表达组患者的无病生存期（disease free survival，DFS）和总生存期（overall survival，OS）均显著低于低表达组（图1C）。为证实上述生物信息学分析结果，本研究选取人正常胃黏膜上皮细胞（GES-1）和4种胃癌细胞系（AGS、SNU668、MKN28和MKN45），采用RT-qPCR和Western blot技术检测DIP2B的表达水平。结果发现，与GES-1细胞相比，胃癌细胞系中的DIP2B蛋白和mRNA表达水平明显升高，其中AGS和MKN28细胞的DIP2B表达水平最高（F=22.66， P0.05，图1D）。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.06.003.F001curves for DIP2B； D： DIP2B protein and mRNA expression in gastric cancer cells； *P0.05， **P0.01， ***P0.001 vs Normal group； #P0.05 vs GES-1 cells.2.2DIP2B低表达细胞模型的构建与验证基于上述实验结果证实DIP2B在胃癌细胞中普遍高表达，本研究选择表达水平较高的AGS和MKN28细胞系进行后续功能研究。通过设计、转染特异性siRNA，DIP2B低表达细胞模型被成功构建。Western blot和RT-qPCR结果显示与NC相比，成功转染siDIP2B后，实验组细胞内DIP2B的蛋白及mRNA表达水平均显著下调，敲减效率高于50%（LSD-t=7.76、9.65、15.82、18.01，均P0.05，图2）。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.06.003.F002图2DIP2B低表达细胞株构建和验证Fig.2Establishment and validation of a DIP2B low-expressing cell lineA： Expression levels of DIP2B protein and mRNA in AGS cells after DIP2B knockdown； B： Expression levels of DIP2B protein and mRNA in MKN28 cells after DIP2B knockdown； *P0.05 vs NC group.2.3DIP2B敲低可以抑制胃癌细胞体外增殖能力为评估DIP2B对胃癌细胞增殖能力的影响，DIP2B敲低后，采用RTCA技术对细胞增殖能力进行检测。结果显示，与NC组相比，DIP2B敲低组AGS和MKN28细胞的增殖能力明显降低（t=15.03、11.64，P0.05，图3A）。克隆形成实验表明，DIP2B敲低组细胞集落数量远少于NC组（t=19.14、33.53，P0.05，图3B）。通过流式细胞仪检测DIP2B敲低后胃癌细胞凋亡的情况。结果显示，DIP2B敲低组AGS和MKN28细胞的凋亡细胞比例明显高于NC组细胞凋亡比例（t=23.71、28.26，P0.05，图3C），上述结果证明，DIP2B敲低后可显著抑制胃癌细胞的增殖能力，并促进胃癌细胞凋亡。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.06.003.F0032.4DIP2B敲低可以抑制胃癌细胞体外迁移和侵袭能力采用Transwell迁移和侵袭实验检测DIP2B敲低后对胃癌细胞迁移和侵袭能力的影响。迁移实验结果表明，在48 h后，DIP2B敲低组细胞迁移数低于NC组细胞（t=39.3、34.72，P0.05，图4A）。Transwell侵袭实验结果表明，NC组通过含基质胶的Transwell小室的细胞数量远多于DIP2B敲低组（t=28.65、36.80，P0.05，图4B）。上述结果表明DIP2B敲低可以抑制胃癌细胞的迁移和侵袭能力。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.06.003.F004图4DIP2B敲低对胃癌细胞迁移、侵袭能力的影响 ×20Fig.4The effects of DIP2B knockdown on the migration and invasion of gastric cancer cells ×20A： Transwell migration assay results； B： Transwell invasion assay results； *P0.05 vs NC group.2.5DIP2B敲低阻滞胃癌细胞分裂采用流式细胞术检测DIP2B敲低后对胃癌细胞周期的影响。结果显示，DIP2B敲低后，与NC组相比，胃癌细胞被显著阻滞在S期（t=9.76、4.01，P0.05，图5A）。单基因富集分析和火山图提示，DIP2B与多种重要基因相关联，涉及调控多条信号通路，参与调控细胞周期进程（图5B、5C）。上述结果表明，DIP2B与胃癌细胞周期关系密切，阻滞胃癌细胞分裂，进而阻碍胃癌细胞的增殖。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.06.003.F005图5DIP2B敲低对胃癌细胞周期的影响Fig.5The effects of DIP2B knockdown on cell cycle progression of gastric cancer cellsA： Flow cytometric analysis showing cell cycle distribution in control and DIP2B knockdown groups； B： Gene set enrichment analysis （GSEA） of cellular pathways involving the DIP2B gene； C： Volcano plot of differentially expressed genes.3讨论当前，胃癌仍然是全球主要的健康挑战，每年新发病例约100万例，死亡病例超过65万例［9］。在这一背景下，探索新的治疗靶点具有重要临床意义。DIP2B是DIP2家族成员之一，该家族还包含DIP2A和DIP2C两个同源基因。DIP2家族成员通过调控多条信号通路参与多种肿瘤的发生发展过程。其中，DIP2A被证实可通过卵泡抑素样蛋白1（follistatin-like protein 1，FSTL1）-DIP2A-p38信号通路上调NK细胞中N核受体共激活因子4（nuclear receptor coactivator 4，COA4）的表达，进而诱导铁死亡［10］。在神经系统疾病中，DIP2A的高表达与脑卒中、自闭症谱系障碍及阿尔茨海默病的发生密切相关［11］。在胶质瘤的研究［12］中结果显示，FSTL1/DIP2A/O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（o-6-methylguanine-DNA methyltransferase，MGMT）信号通路在胶质瘤替莫唑胺耐药中发挥关键作用。而DIP2C则被发现与乳腺癌［13］、恶性黑色素瘤［14］和膀胱癌［15］的发生发展相关。尽管目前有研究显示，DIP2B可以参与调控肺腺癌［16］、乳腺癌［17］、结直肠癌［18］等肿瘤的发生，但其在胃癌中的生物学功能尚未见报道。本研究通过生物信息学分析，结果显示DIP2B在胃癌组织中高表达，并通过Western blot和RT-qPCR实验加以验证，随后的体外功能实验研究结果显示，DIP2B可能作为促癌基因，增强胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力；通过流式细胞术检测细胞凋亡和周期变化，结果显示，DIP2B敲低导致胃癌细胞大量凋亡，细胞周期被阻滞在S期，单基因富集分析结果显示，DIP2B主要参与细胞周期等信号通路，验证了上述实验结果。然而，本研究局限于体外实验，缺乏动物模型验证，且对DIP2B调控胃癌进展的具体分子机制尚未深入阐明。后续研究将重点探讨DIP2B在体内的生物学功能及其作用机制。综上所述，本研究证明DIP2B作为促癌基因参与调控胃癌的恶性进展，为胃癌的靶向治疗提供了新的潜在靶点。这些发现不仅拓展了对DIP2家族蛋白功能的认识，也为进一步研究胃癌的发生发展机制提供了重要线索。