顺铂（cisplatin，Cis）是临床一线抗实体瘤化疗药，常伴有显著肾毒性，极易诱发急性肾损伤（acute kidney injury， AKI），目前尚无有效治疗方法降低其发生率［1］。AKI的病理进程不仅涉及炎症与氧化应激，细胞衰老也发挥重要作用［2–3］。Cis可诱导肾小管上皮细胞衰老，进而阻碍组织修复并加剧肾功能恶化［4］。组蛋白乙酰转移酶7（lysineacetyltransferase 7，KAT7）是调控细胞衰老进程的关键因子，可通过表观遗传机制驱动细胞周期停滞［5］。现有KAT7抑制剂虽具有一定抗衰老作用，但在炎症调控方面效果有限，且治疗窗口较窄［6］。厚朴酚作为中药厚朴的主要活性成分，已被证实具有抗炎和肾保护潜能［7］。该研究基于课题组对厚朴酚结构进行定向修饰，设计合成了厚朴酚酯衍生物（代号：YW），旨在评估其对Cis诱导AKI的作用，并探讨其是否通过调控KAT7发挥作用，为将YW应用于AKI临床治疗提供初步的实验依据。1材料与方法1.1主要试剂、细胞和仪器厚朴酚（货号：528-43-8）、对甲基苯甲酸（货号：99-94-5）购自上海麦克林公司；GAPDH抗体（货号：AF7021）购自美国Affinity公司；肾损伤分子-1（kidney injury molecule-1，KIM-1）抗体（货号：30948-1-AP）、KAT7抗体（货号：13751-1-AP）、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂 1A（cyclin-dependent kinase inhibitor 1A，p21）抗体（货号：10355-1-AP）、兔二抗（货号：SA00001-2）购自武汉三鹰生物技术有限公司；CCK-8试剂盒（货号：BMU106-CN）购自亚科因（武汉）生物技术有限公司；血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）试剂盒（货号：C013-2-1）、血肌酐（serum creatinine，Scr）试剂盒（货号：C011-2-1）购自南京建成生物工程研究所；衰老相关β-半乳糖苷酶（senescence-associated β-galactosidase，SA-β-Gal）试剂盒（货号：C0602）购自上海碧云天生物技术有限公司；人肾小管上皮细胞HK-2（human kidney-2）购自武汉普诺赛科技公司。正置荧光显微镜（型号：DM48）购自德国Leica公司；全波长多功能酶标仪（型号：Infinite M1000 PRO）购自瑞士Tecan公司；艾本德离心机（型号：Centrifuge 5810）购自德国Eppendorf公司。1.2实验动物36只6周龄SPF级雄性C57BL/6J小鼠，体质量20~21 g，购于杭州子源实验动物科技有限公司［许可证编号：SCXK（浙）2024-004］，饲养于SPF级动物房。实验方案经安徽医科大学临床药理研究所伦理委员会批准，伦理批准编号：PZ-2024-024。1.3实验方法1.3.1分子对接采用分子对接技术预测YW与KAT7之间的结合作用。首先，从蛋白质结构数据库网站下载KAT7的晶体结构，存为pdbqt格式。随后对蛋白质结构进行预处理，包括提取原始配体小分子作为参考、去除水分子、添加氢原子并优化侧链氨基酸的质子化状态，以得到适用于分子对接的、能量最低的稳定三维结构。同时，从ChemDraw软件中画出YW的二维化学结构式，并将其导入Discovery Studio 2021（DS 2021）中，进行能量最小化处理和三维结构优化，以获得其最稳定的构象，并准备好作为对接配体。在DS 2021中，将预处理后的KAT7蛋白结构设置为受体，YW分子设置为配体，定义活性口袋。采用CDOCKER对接算法进行分子对接模拟，计算YW与KAT7蛋白之间的结合模式和亲和力。1.3.2动物模型的建立将36只C57BL/6J小鼠在SPF级动物房适应性喂养一周。Cis用无菌生理盐水配制成20 mg/kg，单次腹腔注射Cis诱导AKI动物模型，随机将小鼠分为正常组、模型组、YW低剂量组（17.5 mg/kg YW）、YW中剂量组（35 mg/kg YW）、YW高剂量组（70 mg/kg YW）、阳性药氨磷汀组（200 mg/kg）［8］。对照组和模型组小鼠分别腹腔注射生理盐水与Cis，各YW给药组在造模前4 d开始灌胃给药，正常组和模型组给予等量的溶媒，连续给药7 d。1.3.3组织样本的收集Cis给药72 h后，剪除小鼠胡须，将小鼠麻醉，通过眼球取血法收集血液样本，然后将小鼠脱颈处死后剖开小鼠腹腔，分离两侧肾脏组织。左侧肾经生理盐水冲洗并用滤纸吸干后，置于4%多聚甲醛溶液中固定，以备后续石蜡包埋、切片及HE染色。右侧肾脏置于-80 ℃冰箱中冷冻备用。1.3.4生化指标的检测采集的血液样本于室温下静置2 h，随后在4 ℃条件下以3 500 r/min离心15 min，收集上清液即为血清。按照Scr和BUN试剂盒说明书操作，依次向待测样品中加入相应试剂，并使用酶标仪测定其吸光度值。根据公式计算出血液中的Scr和BUN浓度。剩余的血清样本则保存于-80 ℃冰箱，以备后续使用。1.3.5肾脏HE染色石蜡包埋的小鼠肾组织切片经60 ℃烘箱脱蜡后，使用二甲苯与系列浓度乙醇进行梯度水化，PBS漂洗后进行HE染色（苏木精10 min，伊红2 min）。染色切片经梯度乙醇脱水后在组织切片边缘滴加中性树脂在盖玻片周围封片，利用组织原位细胞扫描分析系统随机采集3个视野，以评估肾组织炎症浸润和肾小管损伤情况并进行病理学评分，肾小管损伤程度（0%～100%），评分0～4分［9］。1.3.6HK-2细胞的培养与分组实验开始前配制YW溶液，取3.84 mg的YW，使用100 μL的DMSO溶液溶解，得到终浓度为100 mmol/L的母液，用0.22 μm滤膜过滤，-20 ℃保存。将HK-2细胞培养于含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基，放置于条件为37 ℃、5%CO2的培养箱。将细胞随机分为：NC组、Cis组（10 μmol/L Cis）、Cis+YW（10 μmol/L Cis +2.5 μmol/L YW）组、Cis+YW（10 μmol/L Cis +5 μmol/L YW）组、Cis+YW（10 μmol/L Cis +10 μmol/L YW）组、Cis+YW（10 μmol/L Cis +20 μmol/L YW）组、Cis+YW（10 μmol/L Cis +40 μmol/L YW）组后同步化培养，Cis诱导在YW预处理2 h后加入培养基，检查各组指标变化，并收集数据。1.3.7CCK-8实验将HK-2细胞按照1×104个/孔接种于96孔板中过夜培养，让细胞贴壁，空白组加入新鲜培养基90 μL，对照组更换不含药物的等量新鲜培养基，实验组更换含不同浓度YW的新鲜培养基干预36 h，进行对应处理后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，避光处理，在37 ℃、5%CO2环境中孵育2 h，用酶标仪在 450 nm 波长下测量每孔的吸光度值，记录实验结果并计算细胞活力。1.3.8Western blot实验取小鼠肾脏组织，于冰上分离肾皮质。精确称取约50 mg组织，置于预冷的1.5 mL离心管中，随后加入500 μL预冷的RIPA裂解液（含1 ℃蛋白酶抑制剂）。使用组织研磨仪均质研磨2 min，4 ℃静置20 min后，于4 ℃、12 000 r/min离心20 min。离心后，吸取上清液至新离心管中，并按上清液体积的1/4加入蛋白上样缓冲液。100 ℃金属浴煮10 min使蛋白质变性得到蛋白样本，所得样品于-80 ℃保存备用。收集Cis及药物干预后的HK-2细胞，提取细胞总蛋白并进行蛋白定量，等量蛋白样品进行电泳分离，通过湿转法将有目的蛋白区域的胶转移至聚偏二氟乙烯膜上，用无蛋白快速封闭液封闭15 min后，将膜与按说明书推荐比例配制的KIM-1、KAT7、p21一抗工作液在4 °C下孵育过夜。兔二抗用5%脱脂奶粉按1∶10 000稀释并室温孵育2 h。用化学发光成像仪显影，并使用ImageJ软件进行蛋白条带定量分析。1.3.9SA-β-Gal染色将HK-2细胞以每孔1×105个细胞密度接种在6孔板中培养24 h，分组给药36 h后按照SA-β-Gal试剂盒说明书进行染色操作，用正置显微镜拍摄记录其结果，计算并统计阳性染色率。1.4统计学处理用GraphPad Prism 10.0软件进行统计分析。数值结果以x¯±s表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间均数比较采用单因素方差分析。P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1分子对接模拟YW与KAT7的结合作用分子对接技术预测YW与KAT7之间的潜在结合作用。对接结果如图1显示，YW与KAT7蛋白之间的结合能为-103.131 3 kcal/moL，YW分子能够嵌入KAT7的活性口袋中，并形成稳定的氢键、疏水相互作用等关键结合模式，表明两者之间具有较强的结合亲和力，提示YW可以与KAT7稳定结合。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.06.001.F001图1分子对接模拟YW与KAT7的结合作用Fig.1Molecular docking simulation of YW binding to KAT7A： Molecular structure and chemical formula of YW； B： Three-dimensional structure diagram of YW and KAT7 protein docking； C： Two-dimensional structure diagram of the interaction between YW and KAT7 protein.2.2YW给药后对Cis-AKI小鼠生化指标的影响结果显示，与正常组相比，造模72 h后的小鼠血清中Scr和BUN水平均明显升高（t=14.33、18.53， 均P0.001），提示AKI小鼠肾功能出现明显异常。与AKI模型组相比较，YW三个剂量给药组、氨磷汀给药组能降低肾损伤小鼠Scr水平（t=9.11、11.95、12.31、13.69， 均P0.001）和BUN水平（t=6.55、8.48、10.68、11.80， P0.01），提示YW给药组对Cis-AKI模型所致肾损伤具有明确的保护作用。见表1。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.06.001.T001表1YW给药后对Cis-AKI小鼠生化指标的影响 （x¯±s，n=6）Tab.1The effects of YW administration on biochemical indicators in Cis-AKI mice （x¯±s，n=6）Detection indexNormalModelYW（17.5 mg/kg）YW（35 mg/kg）YW（70 mg/kg）AmifostineScr （µmol/L）7.57±2.64139.39±22.38###42.56±13.32***26.13±6.17***17.96±6.17***12.91±3.36***BUN （mmol/L）10.86±1.1130.65±2.37###21.94±8.34**16.34±6.16***15.04±5.64***13.80±2.56***###P0.001 vs Normal group； **P0.01，***P0.001 vs Model group.2.3YW给药后对Cis-AKI小鼠肾脏病理影响HE染色显示正常组小鼠肾组织肾小管、肾小球形态结构完整，未见相关病理改变。与正常组相比，Cis-AKI模型组可见严重的炎症细胞浸润、肾小球萎缩、肾小管坏死等，病理评分明显增加（t=19.76， P0.001），各剂量YW给药组均可以不同程度地改善上述组织病理学表现（t=3.97、8.72、10.06、12.47， 均P0.05）。见图2。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.06.001.F002图2YW给药后对Cis-AKI小鼠肾组织HE染色及病理评分图 （x¯±s，n=6）Fig.2HE staining and pathological scoring ofrenal tissues in the Cis-AKI mouse after YW treatment （x¯±s，n=6）B： HE pathological score map of mouse kidney tissue； ###P0.001 vs Normal group； *P0.05， **P0.01， ***P0.001 vs Model group.2.4YW给药后对Cis-AKI小鼠模型肾组织中KIM-1、KAT7及p21蛋白表达的影响Western blot实验结果如图3显示，与正常组相比，Cis-AKI模型组上调了肾脏组织中KIM-1、KAT7及p21蛋白的表达水平（t=9.47、20.64、9.48， 均P0.001），表明Cis成功诱导了AKI衰老相关通路的激活。与Cis-AKI模型组相比，YW各给药组肾脏组织中KIM-1（t=2.89、4.24、6.42， 均P0.05）、KAT7（t=6.24、14.89、17.73， 均P0.05）及p21（t=5.01、6.20、8.12， 均P0.01）蛋白的表达水平均下调，提示YW给药组对Cis-AKI模型肾损伤具有明确的保护作用。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.06.001.F003图3YW下调Cis-AKI小鼠中肾组织KIM-1、KAT7及p21蛋白的表达（x¯±s，n=3）Fig.3YW suppressed the expression of KIM-1， KAT7， and p21 proteins in renal tissue of the Cis-AKI mouse （x¯±s，n=3）2.5YW给药对Cis诱导的HK-2细胞损伤的影响以一定浓度梯度（2.5、5、10、20、40 μmol/L）的厚朴酚酯衍生物YW干预HK-2细胞36 h，加入CCK-8试剂，检测结果显示（图4A），当浓度≤10 μmol/L时，YW对HK-2细胞活力几乎无影响，而当浓度≥20 μmol/L时，YW显著抑制细胞活力（t=19.65、31.20， 均P0.001）；Cis能降低HK-2细胞活力（t=27.61、11.62、16.96， 均P0.001），而YW可以抑制Cis诱导的HK-2细胞活力下降（t=7.25， P0.05）（图4B）。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.06.001.F005图4YW给药对Cis诱导的HK-2细胞损伤的影响 （x¯±s，n=3）Fig.4The effects of YW on Cis-induced HK-2 cell injury （x¯±s，n=3）A： The effects of YW on HK-2 cell viability； B： The effects of YW on Cis-induced HK-2 cell viability； ***P0.001 vs YW （0 μmol/L） group； ###P0.001 vs Normal group； &P0.05， &&P0.01， &&&P0.001 vs Cis group.2.6YW给药后对Cis诱导的HK-2细胞KIM-1、KAT7及p21蛋白表达的影响Western blot实验结果显示（图5），Cis诱导明显上调了HK-2细胞中KIM-1、KAT7及p21蛋白的表达水平（t=12.87、12.39、21.95， 均P0.001），表明Cis成功诱导了HK-2细胞衰老相关通路的激活，而2.5、5、10 μmol/L YW干预36 h后，均下调了Cis诱导的HK-2细胞中KIM-1（t=3.90、3.98、11.20， P0.05）、KAT7（t=3.37、4.93、13.02， 均P0.05）及p21（t=4.00、7.56、8.84， 均P0.05）蛋白的表达。结果表明YW能够有效缓解Cis诱导的HK-2细胞衰老，对HK-2细胞具有保护作用。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.06.001.F004 图5YW 给药后对Cis 诱导的HK-2 细胞SA-β-Gal 染色情况（x¯±s，n=3）Fig.5The effects of YW administration on SA-β-Gal staining in Cis-induced HK-2 cells（x¯±s，n=3） 2.7YW给药后对Cis诱导的HK-2细胞SA-β-Gal染色的影响通过SA-β-Gal染色检测HK-2细胞β-半乳糖苷酶活性，结果如图6显示，与对照组相比，Cis诱导后HK-2细胞β-半乳糖苷酶活性明显增强，细胞蓝染率高于正常组（t=38.53， P0.001），表明Cis组中衰老阳性细胞百分比较正常组增加。与Cis组相比，2.5、5、10 μmol/L YW给药组衰老阳性细胞百分比减少（t=8.88、11.62、17.13， 均P0.01），表明YW能够有效改善Cis诱导的HK-2细胞衰老阳性细胞百分比，从而改善HK-2细胞的衰老。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.06.001.F006图6YW给药后对Cis诱导的HK-2细胞SA-β-Gal染色情况 （x¯±s，n=3）Fig.6The effects of YW administration on SA-β-Gal staining in Cis-induced HK-2 cells （x¯±s，n=3）3讨论AKI是一种以肾功能急剧下降为特征的临床综合征，其发病率高且与慢性肾脏疾病（chronic kidney disease，CKD）进展、心血管事件风险增加密切相关，构成重大的公共卫生负担［10］。Cis因在肾小管上皮细胞蓄积，诱发DNA损伤、线粒体功能障碍、氧化应激及炎症反应，导致细胞凋亡与坏死，其剂量依赖性肾毒性严重限制了抗肿瘤疗效的应用［11］。尽管其肾毒性机制已被部分阐明，但临床上除水化、利尿等支持疗法外，仅有氨磷汀等极少数保护剂被批准使用，且因其自身毒性及有限的疗效，临床应用存在显著局限［12］。因此，寻找有效的靶点和探索靶向小分子治疗药物具有重要的意义。近年来，细胞衰老在AKI发病机制中的作用备受关注。衰老细胞通过分泌表型引发慢性炎症和促纤维化微环境，从而阻碍组织修复并促使AKI向CKD转变［13］。Cis作为常见的AKI诱导模型，通过直接引起肾小管上皮细胞的DNA损伤、线粒体功能障碍及大量活性氧产生，激活p53/p21等衰老核心信号通路，导致细胞周期阻滞，从而诱发急性细胞衰老［14］。p21作为p53下游关键的细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子，是执行细胞周期G1期停滞的核心效应分子［15］。KIM-1在受损肾小管上皮细胞中特异性高表达，既是AKI早期诊断标志物，也通过参与凋亡细胞吞噬和促炎信号放大来加剧肾损伤［16］。KAT7作为近年来通过基因组CRISPR筛选发现的衰老驱动因子，通过组蛋白H3第14位赖氨酸乙酰化（H3K14），激活包括p21在内的多个细胞周期抑制基因的转录，主导衰老程序的启动［17］。本研究显示，在Cis诱导的AKI中，KAT7与p21、KIM-1同步上调，而天然产物厚朴酚的酯化衍生物YW可能通过靶向KAT7抑制肾小管上皮细胞衰老，从而发挥治疗作用。在AKI的治疗药物探索中，源于中药的天然产物因其多靶点、低毒性的特点展现出巨大潜力。厚朴酚虽具有抗炎等药理作用，但受限于水溶性差、生物利用度低、代谢快及靶点不特异等缺陷，需通过结构优化以推动其临床应用［18］。课题组前期研究通过对厚朴酚进行定向酯化修饰，设计并合成了厚朴酚酯衍生物YW。本研究以此为契机，探究其对Cis诱导AKI的保护作用，以KAT7为靶点进行分子对接，预测YW可以与KAT7进行稳定结合。在体外，YW在≤10 μmol/L时对HK-2细胞无明显毒性，且能够抑制Cis诱导的HK-2细胞活力下降，并下调Cis诱导的HK-2细胞中KAT7、p21及KIM-1蛋白表达，显著降低SA-β-Gal阳性细胞比例。在体内，其能显著降低AKI模型小鼠血清中急剧升高的Scr和BUN水平，有效改善Cis导致的肾小管扩张、坏死、管型形成及炎症细胞浸润。这表明YW能够缓解细胞衰老进程，从而减轻组织损伤。综上所述，本研究明确揭示了YW对Cis诱导AKI具有保护作用及阐明KAT7介导的细胞衰老是Cis肾毒性的关键病理环节，证实YW可能通过抑制KAT7有效阻断AKI进展，为将YW开发为一种通过抑制肾小管细胞衰老缓解AKI的新型AKI治疗药物提供初步的实验依据与理论支撑，但其具体机制仍需通过验证KAT7/p21通路、明确YW与KAT7的直接结合以及评估体内药代动力学与长期安全性来进一步阐明。