急性肝损伤（acute liver injury，ALI）是指肝脏在短时间内因多种外源性或内源性有害因素作用，导致肝细胞广泛坏死、肝功能急剧恶化的临床综合征，尤其是化学毒素、药物、酒精和病毒［1］。四氯化碳（carbon tetrachloride，CCl4）是一种典型的肝毒物，广泛应用于诱导ALI的模型研究［2］。成纤维细胞生长因子21（fibroblast growth factor 21，FGF21）是一种肝源性分泌蛋白［3］，在急性损伤或应激刺激下，迅速上调［4］。在对乙酰氨基酚诱导的小鼠肝损伤模型中，肝脏和血清中的FGF21水平急剧增加［5］。与野生型小鼠相比，FGF21敲除小鼠血清转氨酶水平显著升高，肝坏死增加［6］。铁死亡是一种铁依赖性的、以脂质过氧化物累积为特征的调节性细胞死亡形式，近年研究［7］表明其参与CCl4诱导的肝损伤进程。沉寂信息调节因子（sirtuin 1，SIRT1）可激活谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）［8］，抑制磷脂过氧化，从而阻断铁死亡［9］。该研究旨在观察肝脏靶向FGF21过表达对CCl₄诱导急性肝损伤的保护效应，并探讨其与SIRT1/GPX4表达变化及铁死亡相关指标的关系。1材料与方法1.1材料1.1.1实验动物选用24 只普通级别雌性ICR小鼠，8 周龄，体质量为28~32 g，购自北京维通利华研究动物技术有限公司，动物生产许可证编号【SCXK（京）2019-0010】，实验动物使用许可证编号【SYXK（皖）2020-001】。小鼠饲养在适宜的环境中，温度保持在（25±1）℃，湿度保持在（55±5）%，适应性喂养7 d后进行实验操作。本研究方案经广州中医药大学实验动物伦理委员会审查批准（批准号：20260429010）。1.1.2主要试剂FGF21过表达病毒购自山东维真生物科技有限公司；CCl4（货号：C10629429）购自天津欧博凯化工有限公司；玉米油（货号：8001-30-7）购自上海阿拉丁生化有限公司；天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）、丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）（货号：L5008-1、L20110-1）检测试剂盒购自浙江伊利康生物技术有限公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA）试剂盒，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD），谷胱甘肽（glutathione，GSH）和组织铁（货号：AKFA013M、AKAO001M-50S、AKPR008M、AKEN046M）测定试剂盒购自北京盒子生工科技有限公司；实时定量PCR引物购自北京擎科生物科技有限公司；实时定量PCR扩增试剂盒（货号：Q711-02）购自南京诺唯赞生物科技有限公司；FGF21抗体、SIRT1抗体（货号：ab171941、ab189494）和GPX4抗体（货号：ab1250661）购自英国Abcam公司；GAPDH抗体和β-TUBULIN抗体（货号：M20006S、M20005）购自艾比玛特医药科技（上海）有限公司；罗丹明缀合的山羊抗兔IgG和苏木精-伊红染液（货号：BL055A、BL700A）购自合肥白鲨生物科技有限公司。1.1.3主要仪器超纯水仪（美国颇尔公司，型号：Cascada Ⅲ.I 20）；D3024台式高速离心机（美国赛洛捷克公司，型号：5810R）；多功能荧光显微镜（日本奥林巴斯公司，型号：IX73+DP80+Cellsens）；荧光定量PCR仪（美国赛默飞公司，型号：ABI7500）；生物样本均质仪（杭州奥盛仪器有限公司，型号：Bioprep-24R）；激光共聚焦显微镜（德国卡尔蔡司股份公司，型号：LSM 900）；全自动生化分析仪（长春迪瑞医疗科技股份有限公司，型号：CS-T300）；显影仪（上海天能科技有限公司，型号：5200-muLti）；酶标仪（美国伯腾仪器公司，型号：Synergy 2）。1.2方法1.2.1动物模型的建立24只ICR小鼠（8 周龄，雌性）被随机分为Control组、CCl4组、AAV-FGF21组、AAV-FGF21+CCl4组，每组6只。通过尾静脉注射携带GFP标记的AAV8-FGF21腺相关病毒实现肝脏靶向FGF21过表达，对照组注射相应的对照病毒，注射剂量为3×1011 VG。在病毒注射21 d后，CCl4组和AAV-FGF21+CCl4组腹腔注射0.3 mL/kg CCl4溶液诱导ALI模型，Control组和AAV-FGF21组腹腔注射同等剂量玉米油，12 h后进行取材。记录小鼠体质量和肝质量，并计算肝体比，肝体比按以下公式计算：肝体比=肝质量/体质量×100%。1.2.2免疫荧光在封闭前用枸橼酸盐修复液对组织切片进行抗原修复。切片用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）洗涤，然后与罗丹明缀合的山羊抗兔IgG在37 ℃下孵育50 min。用PBS洗涤后，滴加适量DAPI溶液于室温孵育10 min。切片用PBS冲洗并用抗荧光淬灭剂封片，最后使用荧光显微镜观察和拍照，通过ImageJ软件对阳性信号进行量化。1.2.3血清生化检测使用生化分析仪检测血清中ALT、AST含量。1.2.4组织铁、GSH、MDA含量和SOD活性的检测称取100 mg肝脏组织加入1 mL试剂冰浴匀浆，收集匀浆液严格按照试剂盒说明书步骤操作，对肝脏中组织铁、MDA和GSH含量、SOD活性进行检测。1.2.5组织病理学检测取小鼠新鲜肝大叶置于4%多聚甲醛溶液中，室温放置摇床固定24 h。进行脱水、包埋、切片、固定和HE染色后显微镜下观察并拍照。1.2.6Western blot蛋白表达检测精确称取30 mg肝脏组织，加入1 mL裂解液匀浆，4 ℃条件下12 000 r/min离心10 min获取总蛋白，采用酶标仪对蛋白浓度定量。用SDS-PAGE分离等量的总蛋白，用特异性抗体GPX4、SIRT1、GAPDH、β-TUBULIN（1∶1 000）4 ℃孵育一夜后进行Western blot分析，检测目的蛋白的表达，使用ImageJ软件分析计算灰度值积分。1.2.7RT-qPCR检测相关基因采用TRlzol法提取肝脏RNA，使用酶标仪将所提取的RNA样品浓度定量到1 000 ng/μL，逆转录为cDNA后进行扩增操作。选取18S核糖体RNA（18S ribosomal RNA， 18S）为内参基因计算相应基因的相对表达水平。相关引物信息见表1。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.06.010.T001表1基因的引物序列Tab.1The primer sequences of the genesGenePrimer sequence （5′-3′）18SF：GTAACCCGTTGAACCCCATTFGF21F： TTCAAATCCTGGGTGTCAAAR： CAGCAGCAGTTCTCTGAAGCACSL4F：CTTCCTCTTAAGGCCGGGACR：TGCCATAGCGTTTTTCTTAGATTTPTGS2F： GGGCTCAGCCAGGCAGCAAATR： GCACTGTGTTTGGGGTGGGCTGPX4F： GCAACCAGTTTGGGAGGCAGGAR： CCTCCATGGGACCATAGCGCTTCFPNF： ATGGCTACCGCTGGTGTGGCR： CACCTTGCCATCGTTGCGGCHJVF： ATGGGCCAGTCCCCTAGTCR： GACGAGACATACTCGGCATTGSIRT1F： GCAACAGCATCTTGCCTGATR： GTGCTACTGGTCTCACTT1.3统计学处理采用GraphPad Prism 8.0进行数据分析和绘图，所有数据均用x¯±s表示；两组间比较采用独立样本t检验，采用单因素方差分析进行多组间均数的比较，随后进行Tukey事后多重比较检验，P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1FGF21在CCl4诱导的ALI肝脏中表达增加在ALI模型中，与对照组相比，肝脏中FGF21 mRNA和蛋白表达水平在模型组中均升高（t=8.286、6.216，均P0.01）（图1A、1B）。免疫荧光测定显示，相较于对照组，模型组红色荧光增强（t=14.60，P0.01）（图1C）。说明肝脏中FGF21的表达明显升高。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.06.010.F001图1FGF21在ALI中的表达水平 （n=6）Fig.1Expression level of FGF21 in ALI （n=6）A， B： mRNA and protein expression of FGF21 in liver tissues were detected by RT-qPCR and Western blot； C： FGF21 expression in liver tissues were detected by immunofluorescence； a： Control group； b： CCl4 group； **P0.01 vs Control group.2.2FGF21过表达小鼠的构建为检测重组腺相关病毒的肝脏富集情况，观察冰冻切片组织中的荧光表达，结果显示病毒注射成功，重组腺相关病毒在肝脏富集（图2A）。Western blot和RT-qPCR检测结果显示，AAV-FGF21组的FGF21蛋白和mRNA表达量较对照组均增加（t=4.284、6.604，均P0.01）（图2B、2C）。免疫荧光检测结果显示，AAV-FGF21组与对照组相比FGF21蛋白表达水平明显升高（t=25.36，P0.01）（图2D）。以上结果表明FGF21在小鼠肝脏中成功过表达。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.06.010.F002图2过表达FGF21的腺相关病毒的鉴定 （n=6）Fig.2Validation of AAV-mediated FGF21 overexpression （n=6）A： The expression of GFP in liver tissues was detected； B， C： Protein and mRNA expression of FGF21 in liver tissues were detected by Western blot and RT-qPCR； D： FGF21 expression in liver tissues was detected by immunofluorescence； a： Control group； b： AAV-FGF21 group； **P0.01 vs Control group.2.3FGF21减轻CCl4诱导的ALI生化分析结果显示，与对照组相比，CCl4组血清AST、ALT水平（t=11.05、26.05，均P0.01）升高（图3B、3C）。与CCl4组相比，AAV-FGF21+CCl4组小鼠血清AST，ALT均下降（t=9.256、23.580，均P0.01）（图3B、3C）。CCl4组中的小鼠肝体比高于Control组（q=8.182，P0.01），而过表达FGF21显著降低CCl4小鼠肝体比（q=5.719，P0.01）（图3A）。此外，肝脏组织形态学检查和HE染色结果显示（图3D、3E），与对照组相比，CCl4组颜色发生改变、肝脏出现核溶解、坏死、大量炎症细胞浸润，而过表达FGF21后改善了CCl4所引起的病理变化。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.06.010.F003图3肝脏中过表达FGF21对ALI相关指标的影响Fig.3The effects of hepatic FGF21 overexpression on ALI associated parametersA： Liver weight/body weight across experimental groups； B， C： Serum ALT and AST levels in each group； D： Histopathological changes in liver tissues of each group were observed by HE staining； E： Photographs of livers from mice in each group； a： Control group； b： CCl₄ group； c： AAV-FGF21 group； d： AAV-FGF21+CCl4 group； **P0.01 vs Control group； ##P0.01 vs CCl4 group.2.4FGF21减弱了CCl4诱导的小鼠铁死亡与Control组相比，CCl4刺激后，小鼠肝脏组织中铁死亡和铁代谢相关基因ACSL4和PTGS2 mRNA水平升高，FPN和HJV的mRNA水平降低（q=5.640、8.864，均P0.01；q=6.676、16.95，均P0.05）（图4A-4D）。与CCl4组相比，AAV-FGF21+CCl4组铁死亡和铁代谢相关基因ACSL4、PTGS2、FPN和HJV的mRNA水平（q=6.893、6.576、9.949、6.594，均P0.05）均恢复正常（图4A-4D）。进一步检测铁死亡的主要指标铁含量，如图4E所示，与Control组相比，CCl4组的铁含量（q=16.460，P0.01）明显升高，而FGF21过表达后逆转CCl4组铁含量的升高（q=12.750，P0.01）。GSH、MDA和SOD积累是铁死亡的典型特征，检测结果显示，FGF21过表达增加了CCl4诱导的小鼠的GSH水平和SOD活性（q=5.328，P0.01；q=17.320，P0.01），同时降低了MDA水平（q=6.123，P0.01）（图4F-4H）。表明CCl4诱导了肝脏铁死亡，而FGF21过表达能够抑制这一过程。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.06.010.F004图4FGF21过表达对四氯化碳诱导小鼠肝脏铁死亡的影响 （n=6）Fig.4The effects of FGF21 overexpression on carbon tetrachloride induced hepatic ferroptosis in mice （n=6）A-D： ACSL4， PTGS2， FPN and HJV mRNA expression in liver tissues were detected by RT-qPCR； E-H： Iron content， MDA， GSH levels and SOD activity in mouse liver tissues； a： Control group； b： CCl₄ group； c： AAV-FGF21 group； d： AAV-FGF21+CCl4 group； *P0.05， **P0.01 vs Control group； #P0.05， ##P0.01 vs CCl4 group.2.5FGF21过表达上调SIRT1和GPX4表达与对照组相比，CCl4组的SIRT1和GPX4的mRNA和蛋白水平（q=8.504、9.202、6.175、7.313，均P0.05）均降低；与CCl4组相比，AAV-FGF21+CCl4组的SIRT1和GPX4蛋白和mRNA水平（q=4.503、5.178、6.578、7.089，均P0.05）均升高（图5）。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.06.010.F005图5过表达FGF21对SIRT1/GPX4的影响 （n=6）Fig.5The effects of overexpression of FGF21 on SIRT1/GPX4 （n=6）A， B： SIRT1 and GPX4 mRNA expression in liver tissues were detected by RT-qPCR； C： Western blot was used to detect the protein expression of SIRT1 and GPX4 in liver tissues； a： Control group； b： CCl4 group； c： AAV-FGF21 group； d： AAV-FGF21 CCl4 group； *P0.05， **P0.01 vs Control group； #P0.05， ##P0.01 vs CCl4 group.3讨论本研究实验结果显示，在CCl4诱导的小鼠ALI模型中，肝脏靶向过表达FGF21显著降低血清ALT和AST水平，并改善肝脏病理损伤。该保护效应伴随铁死亡相关标志物的逆转，包括ACSL4和PTGS2的mRNA表达下调、肝组织铁蓄积及MDA水平减少、GSH含量和SOD活性升高。同时，SIRT1和GPX4的mRNA及蛋白表达水平均明显上调。这些变化表明，FGF21过表达与SIRT1/GPX4表达上调以及铁死亡特征抑制之间存在关联。既往研究［10–11］已证实FGF21在对乙酰氨基酚、酒精性肝损伤等多种模型中具有保护作用。本研究在CCl4的肝损伤实验中也观察到类似保护效应。近年来，铁死亡被证实是化学性肝损伤的核心环节之一［12］，而抑制铁死亡可保护小鼠的ALI［13］。本研究不仅观察到CCl4诱导后典型的铁死亡特征，同时发现FGF21过表达可逆转这些变化。文献报道显示，SIRT1/GPX4通路在肾脏［14］、心脏［15］等器官的纤维化及缺血再灌注损伤中与铁死亡抑制相关。本研究结果显示，FGF21过表达伴随SIRT1/GPX4表达上调及铁死亡抑制。这些发现提示FGF21的保护作用可能与SIRT1/GPX4表达调控及铁死亡抑制相关，为进一步阐明其潜在机制提供了实验依据。本研究尚存在一定局限性。首先，出于在机制探索初期控制变量的考虑，仅使用了雌性小鼠。然而，性别是影响肝脏代谢、氧化应激及药物反应的关键生物学变量［16］。因此，未来研究必须在雌雄两性小鼠中验证FGF21-SIRT1/GPX4轴的保护作用是否普遍存在，这对任何潜在治疗的临床转化都至关重要。其次，尽管本研究数据提示SIRT1/GPX4表达上调可能参与FGF21的保护过程，但确切的因果关系及详细机制尚需进一步检验。后续研究需要通过回复实验来确证这一机制。最后，FGF21作为上游信号分子，其通过何种跨膜受体及胞内信号传导来最终上调SIRT1的表达，目前仍不清楚［17］。深入阐明这一上游具体机制，将是连接FGF21与其下游通路的关键。综上所述，本研究观察到FGF21过表达与SIRT1/GPX4表达上调及铁死亡特征抑制相关联，从而改善CCl4诱导的ALI。该关联提示SIRT1/GPX4在FGF21对ALI的保护作用中发挥重要作用，但其确切因果关系及上游调控机制仍有待进一步验证。