牙周翻瓣术是重度牙周炎常用的治疗手段，虽能在可视条件下彻底清除根面病灶，但术后创面局部高浓度活性氧、促炎因子会持续破坏牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells，PDLCs）的增殖分化，造成组织修复效率降低［1］。因此，需要研发出兼具抗炎与抗氧化作用的生物材料，来打破“炎症-氧化应激”的恶性循环，提高翻瓣术的疗效。透明质酸（hyaluronic acid，HA）生物相容性好、非免疫原性强，被广泛应用于组织损伤修复领域，但其存在体内降解速度过快及细胞黏附支持不足的缺点［2］，且虽能抑制巨噬细胞的活化而减少局部炎症［3］，但其对氧化应激损伤的对抗能力较弱。丝素蛋白（silk fibroin，SF）体内降解代谢缓慢，同时具有良好的生物相容性、机械性能等，在生物医学和组织工程领域拥有巨大的应用潜力［4］。表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）是一种具有抗炎、抗氧化作用的天然产物，将 EGCG整合到水凝胶中，可增强水凝胶的抗氧化和抗炎性能，同时可促进细胞的增殖和分化［5］。该研究旨在将HA与SF交联合成HA/SF水凝胶支架，负载 EGCG构成复合涂层结构。系统评估该支架的细胞相容性及其对“炎症-氧化应激”的双重效果，为牙周炎治疗提供更好的治疗方案。1材料与方法1.1材料与仪器透明质酸、表没食子儿茶素没食子酸酯（美国Sigma-Aldrich公司，货号：53747-1G、E4268-100MG）；CCK-8试剂盒、LPS脂多糖（北京索莱宝科技有限公司，货号：CA1210-100T、L8880）；α-基础必需培养基（α-minimum essential medium，α-MEM）、杜尔贝科改良伊格尔培养基（dulbecco modified eagle medium，DMEM）、胎牛血清（美国Gibco公司，货号：12561-049、11965-118、10099-141C）；胰酶消化液（苏州新赛美科技有限公司，货号：C100C1）；青-链霉素溶液、钙黄绿素乙酰氧基甲酯/碘化丙啶（Calcein-AM/PI）细胞活性与细胞毒性检测试剂盒、一氧化氮检测试剂盒（Griess法）、2，2’-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸［2，2'-Azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS］抗氧化试剂盒、磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffered saline，PBS）（上海碧云天生物技术有限公司，货号：C0222 、C2015S、S0021S、S0121、C02212A）；小鼠成纤维细胞（L929细胞）、小鼠单核巨噬细胞白细胞（RAW264.7细胞）（美国ATCC，货号：CCL-1、TIB-71）。实验设备包括场发射扫描电子显微镜（日本日立公司，型号：HitachiS-4800）、冷冻干燥机（美国Labconco公司，型号：Free Zone 2.5 Plus）、酶标仪（美国Bio-tek公司，型号：MQX200）、精密电子天平（德国Sartorius公司，型号：BT25S）荧光显微镜（日本尼康公司，型号：NIKON ECLIPSE C1）。1.2制备复合水凝胶支架1.2.1制备HA/SF水凝胶支架计算浓度为3%（W/V）的HA溶液所需去离子水与HA的量，先在去离子水中均匀溶解HA，然后使用磁力搅拌使之完全混合。用同样方法制备3% SF溶液。将透明质酸与丝素蛋白溶液按照体积比为8∶2、6∶4、5∶5、4∶6、2∶8的方式混合［6］，然后依次添加1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐［1-Ethyl-3-（3-dimethylaminopropyl） carbodiimide hydrochloride，EDC］偶联剂和N-羟基琥珀酰亚胺（N-hydroxysuccinimide，NHS）活化剂，充分搅拌制备成共混溶液。去除气泡，-20 ℃中冷冻保存12 h后，通过-70 ℃冻干机进行冷冻干燥3 d，冻干结束后放置于干燥箱中储存备用。1.2.2制备EGCG涂层的HA/SF支架将EGCG溶解于Tris-Hcl溶液中配制成6.35 mmol/L溶液，将上述制备的水凝胶支架浸泡于溶液中避光摇晃24 h后用纯水清洗，在-80 ℃条件下冷冻12 h后转移至冷冻干燥机中冷冻干燥48 h，得到HA/SF/EGCG水凝胶支架，存放于干燥箱中。1.2.3样品表征为分析凝胶支架的微观构造差异，通过对制备的HA/SF水凝胶支架和HA/SF/EGCG复合水凝胶支架进行速冻干燥和喷金处理，使用扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）观察不同样品的表面形貌，并采集对应的结构图像用于后续分析。1.3水凝胶支架理化性能检测1.3.1吸水性采用将支架浸泡在磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffered saline，PBS）中比较前后质量变化的方法检测支架的吸水性能。浸泡前用电子秤称取各组水凝胶支架的干重记录为W1，然后在37 ℃条件下PBS中浸泡24 h，取出目标支架，吸去其表面附着的多余水分，对吸水后的支架进行质量检测，最终将检测得到的数值记录为W2。每组检测3个样本，测量后取其平均值。吸水性=W2/W1。1.3.2可降解性使用电子秤测量每组凝胶支架在干燥状态下的重量，并将该初始重量记录为W1，随后，将支架分别浸泡在PBS和0.05%胰酶溶液中，期间2种溶液定时更换，以确保环境稳定，后续分别在第1、7、14 天3个预设时间点采集对应样品，每个样品经纯水洗涤3次后，再次进行冷冻干燥处理。干燥完成后样品称重并记录数据为W2。每组测量3个样本，测量后取其平均值。降解剩余率=W2/W1×100%。1.3.3抗氧化性能检测将材料浸泡于PBS溶液中24 h，取浸提液于离心管中备用。实验方法：于5 mL离心管中加入1 mL样品溶液和1 mL浓度为0.2 mmol/L的DPPH乙醇溶液，充分混合后，把离心管置于37 ℃避光环境中静置反应30 min；反应结束后，测定混合液在517 nm波长下的吸光度（absorbance， A），测定结果记为A样品。相同反应条件下，用1 mL样品溶液和1 mL上述DPPH溶液混合测得吸光度值为A空白，将1 mL纯水和1 mL上述DPPH溶液混合测得吸光度值为A对照。每个样品做3组重复。自由基清除率RDPPH的计算如下：RDPPH=1-（A样品-A空白）/A对照×100%［7］。ABTS试剂盒可用来检测阳离子自由基清除率。第一步为ABTS母液制备，取试剂盒中的ABTS试剂，与等体积过硫酸钾溶液充分混匀，随后置于无光照条件下反应12~16 h，反应结束后留存待用。下一步对ABTS母液进行稀释操作，通过添加去离子水调整其浓度，参照734 nm波长下A值需满足0.7±0.02的要求，配制得到ABTS工作液。之后开展吸光度检测，取3 mL ABTS工作液，加入1 mL样品溶液，充分混合后置于避光环境反应6 min，最后用酶标仪检测混合溶液在734 nm波长处吸光度，结果记录为A样品。同时设置空白对照组，以1 mL等体积蒸馏水替换样品溶液，与3 mL ABTS工作液混合，在相同反应条件下测定吸光度并记为A空白。最后依据公式（A空白-A样品）/A空白×100%，计算得出阳离子自由基清除率［8］。1.4水凝胶支架的体外生物学检测1.4.1细胞存活率和增殖情况小鼠成纤维细胞（L929细胞）被广泛应用于细胞毒性检测，本研究采用两种方法评估材料对L929细胞的存活率和增殖的影响。将各组水凝胶支架在无菌条件下与细胞共同培养1、3、5天3个时间点，按照设计在对应时间更换含有10% CCK-8染色工作液的培养基，培养箱内继续培养3 h。之后取各组培养基转移至96孔板，每孔100 μL，用酶标仪测定450 nm处的A值。以单纯的完全培养基设置为对照组。依据公式“细胞存活率=（A试验孔-A空白孔）/（A对照孔-A空白孔）×100%”来计算细胞存活率。取对数生长期的L929细胞，将其密度调整至2×104个/mL后接种于24孔培养板，与材料共同培养，培养时间分别为1、3、5天。培养至预定时间后，按试剂盒说明书配制Calcein-AM和PI工作液。去除24孔板内的旧培养基，用PBS洗涤孔板2次后，随后在避光条件下每孔加入250 μL Calcein-AM工作液，室温避光孵育15 min。孵育完成后弃去染液并用PBS洗涤2次，每孔再加入250 μL的PI工作液，在室温避光条件下孵育2 min后吸除孔板内染液再用PBS洗涤2次，最终采用荧光显微镜对各组细胞的染色结果进行显微观察与效果评估，并采集图像，以此来评估细胞存活能力。1.4.2体外抗炎实验经LPS诱导小鼠巨噬细胞分化形成的M1亚型具有促炎作用。于6孔板中接种1×105个/mL的RAW264.7细胞。培养12 h，细胞贴壁后将培养基换为含有0.2%FBS的DMEM培养基饥饿处理24 h，完全培养基调整LPS浓度为6.67×10-6 mmol/L构建炎症模型。将HA/SF组、HA/SF/EGCG组水凝胶支架在无菌条件下加入孔板中，共同培养诱导RAW264.7细胞24 h，对照组不加材料。24 h后取50 µL细胞培养液于96孔板中，加入50 µL NO检测试剂盒中的 Griess试剂A（磺胺溶液）混合，室温下反应5 min，再加入50 µL Griess试剂B（N-1-萘基乙二胺溶液），避光反应10 min。最后使用酶标仪测540 nm波长处的A值，同时以NaNO2绘制标准曲线，计算上清液中NO的浓度。1.4.3qRT-PCR检测炎症相关基因的表达收集炎症模型组与对照组细胞，采用实时荧光定量PCR方法，通过计算2－ΔΔCT值，检测与炎症相关的肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、白细胞介素-6 （interleukin-6，IL-6）基因的表达量，为确保数据准确性，目标基因的表达水平以管家基因GAPDH进行标准化校正，具体引物序列参考下表。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.06.006.T001表1引物序列Tab.1Primer sequencesGenePrimer sequence （5'-3'）GAPDHF： CCTCGTCCCGTAGACAAAATGR： TGAGGTCAATGAAGGGGTCGTTNF-αF： CCCTCACACTCACAAACCACCR： CTTTGAGATCCATGCCGTTGiNOSF： CAACAGGAACCTACCAGCTCACTR： AGCCTGAAGTCATGTTTGCCGIL-6F： CCCCAATTTCCAATGCTCTCCR： CGCACTAGGTTTGCCGAGTA1.5统计学处理所有实验均进行至少3次实验，所得实验数据采用SPSS 27.0统计软件分析。组间两两比较采用t检验，多组数据间比较采用单因素或双因素方差分析，采用Dunnett's t 多重比较检验分别进行两两比较， P0.05为差异有统计学差异。2结果2.1水凝胶支架的制备本研究通过 EDC/NHS 催化交联法成功制备HA/SF 水凝胶支架，图1展示了不同比例组HA/SF支架的大致外观。各组支架虽然比例不同，但是外观上很相似。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.06.006.F001图1水凝胶支架的外观Fig.1Macroscopic appearance of hydrogel scaffolds in each group2.2生物相容性检测结果通过CCK-8试剂盒检测L929细胞在各组水凝胶支架浸提液中的存活率（图2A）和增殖情况（图2B），结果显示，培养第 5 天时细胞存活率范围为 81.13%±2.01% 至 120.93%±2.86%，所有组别细胞存活率均 80%，提示无明显细胞毒性；不同组间细胞存活率整体差异具有统计学意义（F=14.40， P0.01）。第5天细胞存活率Dunnett’t 事后检验显示，与6/4-HA/SF 组相比， 2/8-HA/SF、4/6-HA/SF、5/5-HA/SF及8/2-HA/SF组细胞存活率均显著降低（t=14.84、11.70、4.31、13.28，P0.01）。细胞增殖情况，随着培养时间延长，各组细胞的A值（反映细胞数量）均呈持续上升趋势，说明细胞可正常增殖生长，整体差异具有统计学意义（F=53.51， P0.05）。第5天细胞增殖情况Dunnett’t 事后检验显示，与6/4-HA/SF组比较， 2/8-HA/SF、4/6-HA/SF、5/5-HA/SF及8/2-HA/SF组的细胞增殖情况均显著降低（t=18.33、14.32、2.69、23.17，P0.05）。上述结果表明，各组水凝胶支架均具有良好的生物相容性，其中 6/4-HA/SF 组水凝胶支架的细胞存活率与增殖活性显著优于其他组。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.06.006.F002图2L929细胞在不同比例HA/SF水凝胶支架中的存活率（A）和增殖情况（B）Fig. 2Survival rate （A） and proliferation status （B） of L929 cells in hydrogel scaffolds with different HA/SF proportion*P0.05， **P0.01， ***P0.001 vs 6/4-HA/SF group.2.3吸水性检测结果图3显示各组水凝胶支架均具有较好的吸水性，变化范围为 （6.5±0.30） 至（18.37±0.38）倍， 各组间吸水性存在显著统计学差异（F=171.0，P0.05）。Dunnett’t 事后多重比较检验显示，与6/4-HA/SF组相比，2/8-HA/SF、4/6-HA/SF、5/5-HA/SF及8/2-HA/SF组的吸水性显著降低（t=27.63、11.64、3.57、6.75， P0.05）。综合考虑水凝胶支架的吸水性与生物相容性，本研究选择 6/4-HA/SF 组作为最优载体用于后续 EGCG 的负载及性能评价。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.06.006.F003图3水凝胶支架的吸水性Fig.3Water absorption of hydrogel scaffolds*P0.05， **P0.01， ***P0.001 vs 6/4-HA/SF group.2.4形貌结构扫描电镜（图4）显示，各组的凝胶支架均构建出相互连接的网状多孔结构。这种结构具备两个关键特征：一是支架表面粗糙；二是孔径大小合适。这两个特征为细胞物质交换以及细胞黏附增殖提供了有利的环境。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.06.006.F004图46/4组及负载EGCG组的水凝胶支架外观和扫描电镜结构Fig.4Macroscopic appearance and morphology underscanning electron microscope of the hydrogel scaffoldsin the 6/4 group and the EGCG-loaded group2.5水凝胶支架的降解性能结果显示水凝胶支架在PBS（图5A）溶液中保持较高的结构稳定性，在第14天各组水凝胶支架降解剩余率在92.47%±0.39%至94.65%±0.63%之间，降解率均小于10%；其中，第7天和第14天时，6/4-HA/SF/EGCG 组的降解剩余率显著高于6/4-HA/SF 组（t=6.25、6.23，P0.01）。在0.05%胰蛋白酶（图5B）溶液中表现出较好的生物降解性，在第14天两组水凝胶支架降解剩余率在62.78%±2.27%至64.97%±1.69%之间，两组差异不明显，表明EGCG的存在不显著影响降解动力学；而在无酶的 PBS 环境中，EGCG 可一定程度上延缓支架的降解过程。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.06.006.F005图5水凝胶支架在PBS中（A）和在0.05%胰蛋白酶溶液中（B）不同时间点的降解质量残留率Fig.5Mass remaining ratio of hydrogel scaffolds afterdegradation at different time points in PBS （A）and 0.05% trypsin solution （B） **P0.01 vs 6/4-HA/SF group.2.6抗氧化性能检测结果通过ABTS（图6A）和DPPH（图6B）方法检测材料抗氧化能力，结果显示材料具有较好的抗氧化性。ABTS检测6/4组阳离子自由基清除率为51.77%±2.45%，加入EGCG后清除率提升至72.33%±1.80%，差异有统计学意义（t=11.71， P0.001）；DPPH自由基清除率6/4组为62.01%±1.90%，负载EGCG后清除率为76.43%±2.86%，差异有统计学意义（t=7.27， P0.01）。因此与6/4组相比，负载EGCG后可提高材料的抗氧化性能。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.06.006.F006图6ABTS法（A）和DPPH法（B）检测材料的抗氧化性Fig.6Antioxidant properties of the materials detected by ABTS method （A） and DPPH method （B）**P0.01， ***P0.001 vs 6/4-HA/SF group.2.7负载EGCG对材料生物相容性的影响通过CCK-8检测L929细胞在6/4-HA/SF和6/4-HA/SF-EGCG水凝胶支架浸提液中的存活率（图7A）和增殖情况（图7B），结果显示在两组水凝胶支架中细胞均具有较好的存活和增殖，表明EGCG的存在不影响水凝胶支架的生物相容性（第5天各组水凝胶支架中细胞存活率为91.00%±2.79%至93.03%±2.95%）。通过Calcein-AM/PI染色（图8）观察各组别水凝胶支架中L929细胞在第1、3和5天的分布及存活情况，结果显示各组中均有L929细胞定植，说明负载EGCG水凝胶支架具有良好的生物相容性。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.06.006.F007图7L929细胞在各组水凝胶支架中的存活率（A）和增殖情况（B）Fig. 7Cell viability （A） and proliferation status （B）of L929 cells cultured in different hydrogel scaffolds10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.06.006.F008图8通过活死染色检测L929细胞在各组水凝胶支架中的分布 ×100Fig. 8Distribution of L929 cells in each group of hydrogel scaffolds by live-death staining ×1002.8体外抗炎小鼠巨噬细胞通过LPS刺激后，检测每组NO释放量（图9A）及采用qPCR检测每组对应的炎症基因表达（图9B-9D），组间 NO 释放量存在显著差异（F=164.9， P0.001）；Dunnett’t 多重比较检验显示，与对照组相比，6/4-HA/SF 组和6/4-HA/SF/EGCG 组的 NO 释放量显著降低（t=16.93、38.55， P0.001）。同时，qPCR检测各组炎症因子基因（TNF-α、iNOS、IL-6）的表达，各组间差异均具有统计学意义（F=42.44、94.43、92.44， P0.05）。Dunnett’t 多重比较检验，与对照组相比，6/4-HA/SF 组的炎症因子表达轻度下调（t=5.21、6.19、7.83，P0.05），而 6/4-HA/SF/EGCG 组的炎症因子表达水平较对照组显著降低（t=12.64、21.80、20.05，P0.001），且与6/4-HA/SF 组相比也有显著差异（t=8.76、15.60、12.22，P0.01），表明 EGCG 的加入显著增强了复合水凝胶的抗炎活性。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.06.006.F009图9复合水凝胶支架体外抗炎性能检测Fig.9In vitro anti-inflammatory properties of composite hydrogel scaffoldsA： NO release amount； B-D： Gene expression of inflammatory factors； a： Control group； b： 6/4-HA/SF group； c： 6/4-HA/SF/EGCE group； *P0.05， **P0.01， ***P0.001 vs Control group； ##P0.01， ###P0.001 vs 6/4-HA/SF group.3讨论牙周炎是全球成年人牙齿缺失的首要原因，重度牙周炎位列全球第六大高发慢性非传染性疾病，严重损害患者的口腔健康及生活质量，已成为重要的公共口腔健康问题［9］。该病是由牙周菌群失调引起的慢性炎症性疾病，与多种系统性疾病相关［10］。典型表现为牙龈出血、口臭和局部肿痛，进展后可出现牙周袋形成、牙槽骨吸收，甚至牙齿松动和咀嚼功能下降［11］。牙周局部的炎性刺激会产生大量自由基，引发氧化应激，破坏牙周组织。超氧化物歧化酶作为关键抗氧化酶，能清除活性氧自由基，抑制氧化应激，其含量减少会导致氧自由基生成与清除失衡，加重炎症［12］。临床治疗的核心目标是控制菌斑、消除刺激、控制炎症，保存天然牙及功能，改善患者生活质量［13］。传统牙周基础治疗（龈上洁治、龈下刮治和根面平整）虽能清除大部分菌斑与牙石，对于深牙周袋和复杂解剖结构区域的细菌清除仍存在局限。重度深袋牙周炎患者需要通过翻瓣术来治疗：切开牙龈，翻起黏膜骨膜瓣，暴露病变牙根，清除袋内菌斑、牙石及病灶组织，促进新附着形成［14］。但是翻瓣术为有创操作，术后局部炎症刺激，易出现手术效果不佳或复发。因此，有效控制术后的炎症、减轻氧化应激损伤、促进牙周组织再生，是提升牙周炎疗效的关键。HA和SF作为天然生物材料，生物相容性、可降解性、机械性能和细胞调控能力好，两者复合制备的水凝胶支架孔径结构适宜，机械强度好，具有良好的降解和溶胀性能，能提供良好的物理支撑和组织再生微环境。EGCG具有抗炎和抗氧化生物活性，抗炎是通过抑制核因子κB（NF-κB）和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）等信号通路来减少促炎因子的生成，并调节炎症细胞的活化和迁移；抗氧化通过直接清除活性氧，增强机体抗氧化酶活性及抑制氧化应激相关酶［15–16］ 。本研究将EGCG与HA、SF复合，构建具有“抗炎-抗氧化协同调控”功能的水凝胶支架，实现功能互补与增强。该支架在翻瓣术后应用潜力显著：HA和SF载体具有良好的生物相容性、可降解性和机械性能，降低排异风险；EGCG为抗炎抗氧化的核心成分，下调术区促炎因子的表达、增强抗氧化酶活性以及去除活性氧，协同打破“炎症-氧化应激”恶性循环，减轻术后红肿、渗出等反应，为牙周组织修复再生提供了有利的微环境。该设计有望为牙周炎的治疗带来新的突破，具有较高的临床应用价值。但尚存局限性：虽体外实验表现出色，但其在复杂的口腔环境中的长期稳定性、缓释动力学、抗菌效应以及是否可促进骨组织生长等尚有待进一步研究和验证。此外，患者的牙周状况差异较大，个性化应用需后续研究。综上所述，本研究成功制备了负载EGCG的HA/SF水凝胶支架，通过“抗炎-抗氧化协同调控”机制，有效抑制术区炎症、减轻氧化应激损伤，打破“炎症-氧化应激”恶性循环，为牙周组织的修复再生提供良好的环境，展现出作为翻瓣术等传统治疗手段有效辅助工具的巨大潜力，为重度牙周炎的临床治疗带来了新的希望，值得后续深入研究与探索。