白细胞介素-9（interleukin-9，IL-9）是一种由9型辅助性T细胞（T helper 9 cells，Th9 cells）分泌的免疫调节细胞因子［1］。IL-9可通过激活多种信号通路，调控免疫细胞的活化与增殖，是参与炎症、自身免疫及肿瘤免疫微环境的关键调控因子［2–3］。研究［4］表明，自身免疫性疾病患者血清中IL-9水平升高，其表达水平与组织炎症呈正相关。2026 - 录用;接受;:03 - 13 接收抗体通过识别致病抗原表位来保护宿主免受感染细胞的侵害，包含两条重链可变区（variable heavy chain，VH）与两条轻链可变区（variable light chain，VL），通过二硫键连接［5–6］。每条VH有1个可变区和3个恒定区，每条VL有1个可变区和1个恒定区，其中单克隆抗体（monoclonal antibody，mAb）由识别单一抗原表位的同一克隆B细胞产生，具有高度特异性［7–8］。治疗性mAb作为外来大分子可诱发机体产生抗药抗体（anti-drug antibody，ADA），进而引发不必要的免疫反应，而抗体人源化可有效降低其免疫原性，减轻机体排异反应，提高非人源抗体的应用安全性。对IL9-2G1兔单克隆抗体进行可变区人源化改造并对其生物学活性进行鉴定，具有重要的研究价值。1材料与方法1.1实验细胞T淋巴细胞白血病细胞Jurkat、中国仓鼠卵巢细胞（Chinese hamster ovary，CHO）购自武汉普诺赛生命科技有限公司；Naive T细胞经体外分离纯化获得，在极化诱导条件下定向分化为Th9细胞，所有细胞均置于37 ℃、5% CO₂恒温培养箱中常规培养。1.2主要材料M501042-AH、M501042-AL、M501042-BH、M501042-CH、M501042-EH、 M5010 42-FL、M501042-GL、M501042-IL、M501042-MH、M501042-NH、M501042-JL、M501042-KL、M501042-LL、M501042-OH、M501042-PH、M501042-QH、M501042-RH、M501042-SH（货号：25120093、2512 0094、25120095、25120096、25120097、25120098、25120099、25120100、25130287、25130288、251 30289、25130290、25130291、25140378、25140379、25140380、25141096、25141096）均购自武汉金开瑞生物工程有限公司；ELISA试剂盒（货号：E-EL-H0180）购自中国Elabscience公司；Janus激酶1（janus kinase 1，JAK1）、p-JAK1、信号转导与转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）、p-STAT3（货号：3344T、3331S、9139T、9145S）购自美国Cell Signaling Technology公司。1.3实验仪器酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific公司，型号：Multiskan FC）；CO2培养箱（上海博旅仪器有限公司，型号：P-90A）；电泳仪（美国Bio-Rad公司，型号：PowerPac Basic）；Biacore T200分子相互作用分析仪（美国Cytiva公司，型号：Biacore T200）。1.4实验方法1.4.1IL9-2G1兔单克隆抗体人源化设计思路第一步，将IL9-2G1的VH与VL移植到免疫球蛋白G1重链恒定区（immunoglobulin G1 constant heavy chain，IgG1-CH）及免疫球蛋白κ轻链恒定区（immunoglobulin kappa constant light chain，Ig-kappa-CL）恒定骨架上，构建兔人嵌合抗体用于后续对照。第二步，针对VH，基于2种不同的人源种系（IGHV3-53*04、IGHV4-28*02）构建产生2个人源化VH；同理，VL也基于2个人源种系（IGKV1-39*01、IGKV3-15*01）构建产生2个人源化VL，纯化4个mAb来评估人源化适配度。第三步，与人源化筛选过程平行，探索互补决定区（complementarity-determining region，CDR）中人源种系骨架对应氨基酸的替换，在保持最大人源化程度的基础上维持抗体对IL-9抗原的特异活性及亲和力。1.4.2纯化IL9-2G1人源化抗体的电泳鉴定针对设计的人源化版本VH及VL，采用CHO细胞表达系统进行纯化测试。接种细胞，孵育24 h至细胞密度约1.0×106个/mL后，吸取20 μg的DNA加入2 mL PBS中，再将80 μL过滤除菌的PEI溶液（0.5 mg/mL）加入PBS/DNA的混合液中。转染后置于37 ℃、120 r/min、5% CO₂的摇床培养箱中培养6 d，培养上清液经0.22 μm滤膜过滤后，与Protein A树脂结合纯化目的蛋白。组装电泳槽，依次加入蛋白样品及Marker进行电泳分离，染色后拍照记录。1.4.3ELISA检测IL9-2G1人源化抗体的抗原结合活性用0.05 mol/L碳酸盐（pH=9.6）稀释抗原IL9蛋白至6 μg/mL，4 ℃孵育过夜。PBST洗涤后，加入150 μL脱脂奶粉封闭液，37 ℃封闭1 h。将不同VH与VL配对抗体按照1∶1 000倍比稀释，37 ℃孵育1 h。加入辣根酶标记山羊抗兔IgG（H+L）/山羊抗人IgG（H+L），1∶5 000稀释，37 ℃孵育1 h。3，3′，5，5′- 四甲基联苯胺（3，3′，5，5′-tetramethylbenzidine， TMB）显色5~10 min，100 μL 2 mol/L硫酸终止反应，用酶标仪在450 nm处测定吸光度（absorbance，A）。以空白孔为对照，计算出信号与背景比值（signal-to-background ratio，S/B），S/B≥2.1判定为抗原结合阳性（+），S/B2.1为阴性（-）。本实验为前期单次筛选，主要用于快速淘汰无抗原结合活性的抗体，后续将对阳性进行重复验证。1.4.4表面等离子体共振（surface plasmon resonance，SPR）检测IL9-2G1人源化抗体的结合亲和力采用Biacore T200分别检测亲本抗体2G1、嵌合抗体AHAL、人源化抗体OHFL与IL9蛋白的亲和力，使用Biacore T200分析软件对数据进行处理，扣除参比通道与零浓度背景信号，采用1∶1结合模型进行分析，得到结合速率常数ka与解离速率常数kd后，通过KD=kd/ka计算出平衡解离常数以此评估各抗体的亲和力水平。1.4.5蛋白质印迹法（western blot，WB）检测hIL-9 mAb对Jurkat细胞JAK1/STAT3信号通路的影响将Jurkat细胞分为3组：对照组（不加rIL-9及IL-9 mAb）、rIL-9处理组（仅加入100 ng/mL rIL-9）、rIL-9+IL-9 mAb处理组（100 ng/mL IL-9 mAb预孵育24 h后，再加入100 ng/mL rIL-9）。孵育结束弃去培养基，PBS洗涤2次后加入RIPA裂解液提取总蛋白。配制10%分离胶和5%浓缩胶，取30 μg变性蛋白样品上样，同时加入3 μL Marker，接通电源设置恒压80 V电泳15 min，再调整电压至恒压120 V，继续电泳30 min。电泳结束后，恒流200 mA，90 min将凝胶上的蛋白转移至PVDF膜上。将膜置于封闭液中室温封闭1 h，洗涤后加入稀释好的一抗（p-JAK1、JAK1、p-STAT3、STAT3、ACTIN，1∶1 000），4 ℃ 孵育过夜。次日，加入HRP标记的二抗（1∶10 000），孵育1 h后显影。1.4.6ELISA检测hIL-9 mAb对Th9细胞IL-9分泌水平的影响将Naive T细胞分为3组：Naive T cell组（不进行诱导处理）、Th9组（细胞因子诱导下分化为Th9细胞）、Th9+hIL-9 mAb组（在诱导分化的同时，加入100 μL 100 ng/mL hIL-9 mAb）。培养3 d后，细胞悬液1 500 r/min离心10 min，收集上清液。具体实验操作同“1.4.3”项，计算出IL-9的浓度（pg/mL）。1.4.7亲本抗体信息IL9-2G1兔单克隆抗体重链可变区（2G1-VH）及轻链可变区（2G1-VL）氨基酸序列（Kabat编号）：黄色为CDR区域，红色加粗为核心残基，橙色删除线为待优化的非编号氨基酸（图1A、1B）。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.06.001.F001图12G1-VH （A）及2G1-VL（B）氨基酸序列分析Fig.1Analysis of amino acid sequences of 2G1-VH （A） and 2G1-VL （B）1.4.8第一代人源化IL9-2G1抗体构建与序列优化将按Kabat命名法定义的亲本CDR分别移植到IGHV3-53*04、IGHV4-28*02、IGKV1-39*01、IGKV3-15*01，得到版本BH、DH、FL、HL。其中亲本VH、VL序列中保守氨基酸位置对维持VH-VL结构及抗体全部活性至关重要。版本CH、EH、GL、IL则是在版本BH、DH、FL、HL基础上，针对亲和抗体核心氨基酸残基进行回复突变获得。针对上述设计的人源化版本，采用CHO细胞表达系统进行表达纯化电泳染色，并通过ELISA检测人源化抗体与抗原的结合活性。1.4.9第二代人源化IL9-2G1抗体构建与序列优化基于第一次人源化版本抗体的表达与纯化结果，继续在GL上调整氨基酸突变，同时根据第一版设计结果额外设计两条VH与三条VL，最终得到VH（MH、NH）与VL（JL、KL、LL），继续进行配对优化。ELISA检测人源化抗体与抗原的结合活性。1.4.10第三代人源化IL9-2G1抗体构建与序列优化接下来将继续在MH上调整氨基酸突变，轻链格式保持不变，最后得到VH（OH、PH、QH、RH、SH），重新进行抗体配对测试，ELISA检测人源化抗体与抗原的结合活性。1.4.11最终版本人源化IL9-2G1抗体构建与序列优化针对OHFL、OHIL及QHIL的配对抗体，同时设置亲本抗体2G1、嵌合抗体AHAL作为对照，CHO细胞表达系统进行纯化电泳及ELISA检测人源化IL9-2G1抗体。1.5统计学处理采用GraphPad Prism 10软件进行数据分析以及统计图表的制作，以（x¯±s）表示，组间比较采用独立样本t检验，以P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1第一代人源化IL9-2G1抗体纯度鉴定对第一代人源化抗体进行纯度鉴定。结果显示，相较于对照组AHAL（图2A），BH重链纯化后IN处杂蛋白较少，E1-E8条带清晰、蛋白信号强、结合效率高，可与FL、GL、IL三种轻链正常配对表达（图2B-2D），CH重链条带清晰，整体表达及纯化效果与BH组相近（图2E-2G）。EH重链IN杂蛋白较多，E1-E6无明显目的蛋白条带，表明EH重链不能与各轻链形成稳定抗体结构，无法兼容表达（图2H-2J）。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.06.001.F002图2第一代人源化IL9-2G1抗体的纯化分析Fig.2Purification analysis of the first-generation humanized IL9-2G1 antibodyM： Marker；IN： Loading solution； FT： Flow-through solution；W：Washing solution； E1-E8： Different gradient elution components；A：M501042-AHAL；B：M501042-BHFL；C：M501042-BHGL；D：M501042-BHIL；E：M501042-CHFL；F：M501042-CHGL；G：M501042-CHIL；H：M501042-EHFL；I：M501042-EHGL； J：M501042-EHIL.2.2第一代人源化IL9-2G1抗体与抗原结合的定性分析ELISA检测第一代人源化抗体的抗原结合活性（表1）。结果显示，在2 K及128 K稀释度下阳性对照AHAL与亲本2G1抗体结合相近显阳性。2 K下BH组（BHFL、BHGL、BHIL）与CH组（CHFL、CHGL、CHIL）抗体均显阳性，但S/B明显低于AHAL与2G1，128 K稀释度下，上述抗体的结合信号快速下降，均显阴性。EH组在2 K及128 K下均显阴性，未表现出明显的抗原结合活性。相较于FL、IL轻链组合，GL组合活性保留最优。因此，后续将在GL上调整氨基酸突变，同时基于第一代设计结果额外设计两条人源化重链及两条人源化轻链，继续进行配对优化。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.06.001.T001表12K及128K下第一代人源化IL9-2G1抗体与抗原的结合活性Tab.1Binding activity of the first-generation humanized IL9-2G1 antibody to the antigen at 2 K and 128 KAntibody2 K128 KAS/BResultAS/BResult2G11.0797.488+0.6014.171+AHAL1.3709.508+0.5723.970+BHFL0.7555.240+0.1410.979-BHGL0.7935.503+0.1451.006-BHIL0.6724.664+0.1410.979-CHFL0.7485.191+0.1410.979-CHGL0.8175.670+0.1420.985-CHIL0.7835.434+0.1531.062-EHFL0.1751.215-0.1440.999-EHGL0.1731.201-0.1471.020-EHIL0.1651.145-0.1410.979-2.3第二代人源化IL9-2G1抗体与抗原结合活性的定性分析ELISA检测第二代人源化抗体的抗原结合活性（表2）。结果显示，阳性对照AHAL与亲本2G1抗体抗原结合活性相近显阳性。MH重链与其他轻链兼容性良好，均显阳性且S/B有所提升，NH重链与轻链配对后均表现为阴性，无特异性抗原结合活性。因此，接下来将继续在MH上调整氨基酸突变，保留轻链格式不变，重新进行配对测试。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.06.001.T002表2第二代人源化IL9-2G1抗体与抗原的结合活性Tab. 2Binding activity of the second-generation humanized IL9-2G1 antibody to the antigenAntibodyAS/BResult2G11.34519.214+AHAL1.12616.086+MHFL2.74039.143+MHGL1.24917.843+MHIL2.60537.214+MHJL1.65123.586+MHKL1.51821.686+MHLL1.69224.171+NHFL0.0731.043-NHGL0.0480.686-NHIL0.0721.029-NHJL0.0741.057-NHKL0.1071.529-NHLL0.1051.500-2.4第三代人源化IL9-2G1抗体与抗原结合活性的定性分析ELISA检测第三代人源化抗体的抗原结合活性（表3）。结果显示，阳性对照AHAL与亲本2G1抗体抗原结合活性相近显阳性。其中OHFL（9.571）、OHIL（9.151）、QHIL（8.857）均显阳性，表现出良好的抗原结合活性，而PH、QH、RH、SH重链组合的信号均显阴性，未表现出特异性结合活性（未逐一列出）。综上，OHFL、OHIL及QHIL为第三代人源化抗体中抗原结合活性最优的候选组合，可作为后续进一步优化对象。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.06.001.T003表3第三代人源化IL9-2G1抗体与抗原的结合活性Tab. 3Binding activity of the third-generation humanized IL9-2G1 antibody to antigenAntibodyAS/BResult2G11.42211.286+AHAL1.45811.571+OHFL1.2069.571+OHGL0.2511.992-OHIL1.1539.151+OHJL0.1381.095-OHKL0.1991.579-OHLL0.2421.921-QHFL0.1731.373-QHGL0.2031.611-QHIL1.1168.857+QHJL0.2021.603-QHKL0.1621.286-QHLL0.1691.341-2.5最终版本人源化抗体IL9-2G1纯度鉴定对亲本抗体2G1、阳性对照AHAL及第三代候选抗体OHFL、OHIL、QHIL进行纯化检测（图3）。结果显示，OHFL中E2-E6条带清晰、杂带少，蛋白纯度高，OHIL条带信号强度整体弱于OHFL，QHIL中E2-E4条带过浓且ELISA检测中抗原结合活性低于OHFL。综上，OHFL满足高效表达、稳定及高水平抗原结合活性，因此选择人源化抗体OHFL进行后续的SPR亲和力检测。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.06.001.F003图3最终版本人源化IL9-2G1抗体的纯化分析Fig. 3Purification analysis of the final version of the humanized IL9-2G1 antibody A： M30903-2G1； B： M501042-AHAL； C： M501042-OHFL； D： M501042-OHIL； E： M501042-QHIL.2.6人源化抗体OHFL与M30903蛋白的结合亲和力在62.5~1 000 nmol/L不同抗原浓度梯度条件下，SPR检测M30903-2G1、M501042-AHAL及M501042-OHFL与M30903蛋白结合的亲和力，结果显示（图4-图6），亲本抗体2G1 KD值是1.75×10⁻⁷ mol/L，AH-AL为1.49×10⁻⁷ mol/L，OHFL为1.33×10⁻⁷ mol/L。与亲本相比，OHFL的KD值有所降低，表明人源化改造后的抗体与抗原结合稳定性强、亲和力高。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.06.001.F004图42G1抗体与M30903蛋白的结合亲和力Fig. 4Binding affinity of 2G1 antibody to M30903 protein10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.06.001.F005图5AHAL抗体与M30903蛋白的结合亲和力Fig. 5Binding affinity of AHAL antibody to M30903 protein10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.06.001.F006图6OHFL与M30903蛋白的结合亲和力Fig. 6Binding affinity of OHFL antibody to M30903 protein2.7最终版本人源化抗体OHFL序列　OH全长VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGITLSSNAMGWVRQAPGKGLEWIGVITSSGTIFYTSWAKGTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGGYDGVGGDYAFLGIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*FL全长DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCQASQSIGSSLSWYQQKPGKAPKLLIYEASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQSYYYSGISSYAFTFGPGTKVDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC*。2.8hIL-9 mAb对rIL-9诱导JAK1/STAT3磷酸化的影响采用Western blot检测Jurkat细胞中JAK1/STAT3通路的磷酸化水平（图7）。未加rIL-9刺激的对照组中，p-JAK1与p-STAT3水平均较低；经rIL-9刺激后，与对照组相比，p-JAK1（P0.05，t=3.472）与p-STAT3（P0.01，t=4.672）水平显著上调，而总JAK1、总STAT3表达无明显变化，rIL-9可有效激活JAK1/STAT3信号通路；加入rIL-9+hIL-9 mAb干预后，与单纯rIL-9刺激组相比，p-JAK1水平显著下调（P0.01，t=5.504），p-STAT3水平也显著下调（P0.01，t=6.040），表明hIL-9 mAb可通过阻断IL-9的生物学效应，抑制JAK1/STAT3通路的磷酸化活化。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.06.001.F007图7hIL-9 mAb对rIL-9诱导JAK1/STAT3磷酸化的影响Fig. 7The effects of hIL-9 mAb on the phosphorylationof JAK1/STAT3 induced by rIL-9*P0.05， **P0.01 vs Control group； ##P0.01 vs rIL-9 group.2.9hIL-9 mAb对Th9细胞分泌IL-9的影响采用ELISA检测不同处理组细胞上清液中IL-9的分泌水平（图8）。Naive T细胞组中，IL-9分泌水平极低；经诱导分化的Th9细胞组中，IL-9分泌水平显著上调（P0.000 1，t=12.38），加入抗IL-9单抗干预的Th9+hIL-9 mAb组中，IL-9分泌水平较单纯Th9组显著下调（P0.01，t=6.608），表明hIL-9 mAb可有效抑制Th9细胞的IL-9分泌。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.06.001.F008图8hIL-9 mAb对Th9细胞分泌IL-9的影响Fig. 8The effects of hIL-9 mAb on the secretion of IL-9 by Th9 cells****P0.000 1 vs Naive T cell group； ##P0.01 vs Th9 group.3讨论IL-9主要由Th9细胞分泌，通过JAK/STAT信号通路广泛作用于多种免疫细胞，可调控Th17、Treg、B细胞等的功能，并通过细胞与靶细胞间的相互作用参与炎症反应、自身免疫病及肿瘤免疫调控过程［9–10］，因其在体内平衡及多种炎症性疾病中的多重功能而得到认可［11］。与免疫系统相互作用的外源性物质表现出抗原性，而具有免疫原性的抗原可诱发先天性或适应性免疫应答，进而引起体液或细胞介导的免疫，产生ADA，对药物疗效产生不利影响［12–13］。近年来，靶向治疗已成为新兴的治疗手段［14］，由于单克隆抗体作为高特异性的免疫治疗剂可精准靶向特定器官、组织或细胞，单克隆抗体在自身免疫性疾病中的应用也日益广泛［15］。兔单克隆抗体（RabMAb）能够识别多种表位［16］，而人源化单克隆抗体则是将动物来源抗体的CDR移植至人源抗体框架中，此类抗体约95%的序列为人源序列，可有效降低ADA的产生，是降低动物源性抗体相关潜在免疫原性风险的关键技术［17］。对IL9-2G1兔单克隆抗体进行人源化改造，通过CDR移植人源框架区回复突变，进行多代人源化抗体的构建、配对筛选与功能验证，最终获得兼容性良好、效价稳定的人源化抗体OHFL。本研究第一代人源化抗体结果显示，BH、CH重链可与多条轻链实现有效配对，但抗原结合活性明显下降，因此继续进行配对优化。第二代中，MH重链与其他轻链兼容性良好，且抗体活性较第一代有所提升，继续进行配对优化。第三代人源化抗体，重链OH与轻链FL、IL及重链QH与轻链IL配对后，均表现出良好的表达水平、配对兼容性及稳定效价。随后经纯化验证及SPR亲和力检测，最终选定OHFL人源化抗体为最终版本。接下来对hIL-9 mAb进行验证，Western blot实验证实hIL-9 mAb可显著抑制rIL-9诱导的JAK1/STAT3通路磷酸化，表明该抗体对IL-9下游信号具有阻断作用，ELISA进一步证实hIL-9 mAb可有效降低Th9细胞分泌IL-9的水平，表明该抗体可能参与免疫病理微环境中IL-9的自分泌放大效应。目前抗体的人源化改造最大的挑战是改造后抗体的效价与亲和力易受影响，甚至大幅降低，难以保持原有的抗体生物学活性。本研究成功构建并筛选获得高亲和力、高人源化比例、功能明确的hIL-9 mAb OHFL，为后续IL-9相关自身免疫性疾病的治疗提供了实验基础。