化疗性肠道黏膜损伤（chemotherapy-induced intestinal mucosal injury， CIMI）是化疗过程中常见不良反应，尤多见于接受5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil， 5-FU）治疗的患者［1］。表现为严重腹泻、腹痛及营养不良，不仅显著降低患者生活质量，更常导致化疗减量、中断甚至终止，直接影响抗肿瘤疗效与生存预后［2］。目前，针对CIMI尚无标准治疗策略［3］，亟须探索新型干预手段。肠道菌群对修复黏膜损伤至关重要，已有研究［4–5］表明，肠道中高丰度的乳杆菌属是避免放化疗肠损伤的关键因素，然而，不同菌株的功能及临床疗效存在显著差异，且其潜在机制尚未完全明确，亟须筛选更有效的益生菌并阐明其机制。作为乳杆菌属的重要成员，罗伊氏粘液乳杆菌（Limosilactobacillus reuteri， L. reuteri）已被证实具有调节免疫、改善代谢等多种保护作用［6–8］。肠道菌群主要通过代谢产物发挥生物学功能，深入解析这些代谢产物对于理解益生菌作用机制至关重要［9–11］。鉴于此，该研究探讨L. reuteri对5-FU诱导的CIMI保护作用，并结合盲肠内容物非靶向代谢组学分析其对肠道代谢谱的调控，以筛选关键差异代谢物及相关通路，阐明其缓解CIMI的潜在机制，为益生菌在黏膜损伤治疗领域的应用提供新的理论依据与实验支持。1材料与方法1.1主要材料1.1.1实验动物SPF级C57BL/6J 雄性小鼠，7周龄，体质量（20 ± 2）g，共24 只，购自北京斯贝福生物技术有限公司［生产许可证号：SCXK（京）2019-0010］。所有小鼠在安徽医科大学实验动物中心SPF级屏障环境下适应性饲养1周。饲养条件为温度（22 ± 2）℃、相对湿度（55 ± 5）%，光照/黑暗周期12 h/12 h，自由饮水及提供标准饲料。所有动物实验均严格遵循动物福利伦理原则，并经安徽医科大学动物伦理委员会审查与批准（伦理编号：LLSC20242491）。1.1.2主要试剂5-FU（批号：2101301，天津金耀药业有限公司）；闭合紧密连接蛋白（Occludin）、紧密连接蛋白1（zonula occludens-1， ZO-1）抗体（货号：ab216327、ab221547，英国Abcam公司）；山羊抗兔IgG-HRP（货号：GB23303，武汉赛维尔生物科技有限公司）；粪便总DNA提取试剂盒［货号：DP328，天根生化科技（北京）有限公司］；TRIzol试剂（货号：BS258A，安徽白鲨生物科技有限公司）；Hieff ®qPCR SYBR Green Master Mix （No Rox）试剂盒［货号：11201ES03，翌圣生物科技（上海）股份有限公司］；L. reuteri（株号：BNCC186138，购自北京BeNa菌种保藏中心），该产品用途包括益生菌食品生产及改善肠道炎症。1.2方法1.2.1动物分组与处理在适应性饲养结束后，将所有C57BL/6小鼠按照体质量随机分为3组：空白对照组（Control）、模型组（Model）和L. reuteri组，每组8只。第1~10天，L. reuteri 治疗组小鼠每天灌胃200 μL L. reuteri溶液（1×109 CFU/mL），Control组和Model组每天灌胃等体积的无菌PBS，第5~10天， Model组和L. reuteri治疗组小鼠每日在灌胃2 h后腹腔注射5-FU（65 mg/kg），Control组则腹腔注射等体积的无菌PBS。在最后1次注射5-FU 24 h后，所有小鼠在禁食12 h后，吸入2%异氟烷麻醉，采用颈椎脱臼法处死，迅速获取回肠组织、盲肠内容物和血清。回肠组织用4%多聚甲醛固定或液氮速冻保存；盲肠内容物和血清立即置于-80 ℃冰箱保存备用。1.2.2HE染色将新鲜回肠组织迅速置于4%多聚甲醛中固定24~48 h，经梯度乙醇脱水、二甲苯透明后，常规石蜡包埋。包埋组织块切片，厚度为4 μm，展片后烘烤过夜。按标准HE染色法进行染色。染色后，使用光学显微镜（型号：IX83，日本Olympus公司）观察并采集肠道组织形态图像。采用Image-Pro Plus 6.0软件，在每个小鼠样本中随机选取4个不重叠的视野，每个视野测量至少5个完整绒毛的长度及其对应的隐窝深度。测量绒毛顶端到与隐窝汇合点的距离为绒毛长度；两个相邻绒毛之间的凹陷深度为隐窝深度。1.2.3免疫组织化学染色将石蜡包埋的回肠切片经二甲苯脱蜡和梯度乙醇水化。随后进行抗原高压修复。冷却后，用2% H2O2阻断内源性过氧化物酶活性10 min。使用含10%正常山羊血清的PBS缓冲液在室温下孵育20 min。分别加入稀释的一抗：Occludin（1∶200）和ZO-1（1∶500），37 ℃湿盒孵育60 min。用PBS清洗3次，每次5 min。加入HRP标记的山羊抗兔IgG二抗（1∶200），37 ℃孵育20 min。PBS 清洗3次后，DAB显色液显色，显微镜下控制显色时间。苏木精复染细胞核，脱水后中性树胶封片。使用光学显微镜（型号：IX83，日本Olympus公司）观察并采集图像。采用Image-Pro Plus6.0软件，在每个小鼠样本中随机选取4个不重叠的视野，通过测定阳性染色的累积光密度值（integrated optical density， IOD），定量分析ZO-1和Occludin蛋白的相对表达水平。1.2.4粪便DNA提取在实验结束时，收集各组小鼠新鲜粪便样本，并立即置于-80 ℃保存。参照粪便总DNA提取试剂盒说明书提取粪便总DNA。提取的DNA用于后续L. reuteri的定量PCR分析。1.2.5总RNA提取和RT-qPCR使用TRIzol试剂参照说明书提取总RNA。使用Nanodrop分光光度计（型号：NanoDrop Eight，美国Thermo Fisher Scientific公司）测定RNA纯度和浓度（A260/A280比值），参照反转录试剂盒［11151ES60，翌圣生物科技（上海）股份有限公司］说明书将总RNA逆转成cDNA。根据Hieff ®qPCR SYBR Green Master Mix （No Rox）试剂盒说明书，结合特定引物，根据PCR系统，进行RT-qPCR。95 ℃预变性5 min；40个循环（95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s）；终延伸72 ℃ 5 min。采用2-ΔΔCT法计算mRNA相对表达水平。引物序列详见表1。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.06.015.T001表1引物序列Tab.1Primer sequencesGene symbolForward sequence （5′-3′）Reverse sequence （5′-3′）ZO-1ACCCGAAACTGATGCTGTGGATAGAAATGGCCGGGCAGAACTTGTGTAOclnATGTCCGGCCGATGCTCTCTTTGGCTGCTCTTGGGTCTGTATCldn4GGAGGGCCTCTGGATGAACTGATGCTGATGACCATAAGGGCMuc1CCCTATGAGGAGGTTTCGGCGTGGGGTGACTTGCTCCTACMuc2AGGGCTCGGAACTCCAGAAACCAGGGAATCGGTAGACATCGL. reuteriGTGCTTGCACCTGATTGACGCCATTGTGGCCGATCAGTCT18sRnaAGTCCCTGCCCTTTGTACACACGATCCGAGGGCCTCACT1.2.6代谢组学样本的提取与处理取100 mg液氮研磨的盲肠内容物样本，加入500 μL的80%（V/V）甲醇水溶液，涡旋振荡，冰浴静置5 min，于4 ℃、12 500 r/min离心20 min。取一定量的上清液，用质谱级水稀释至甲醇终含量为53%（V/V）；再次于4 ℃、12 500 r/min离心20 min，收集上清液。将各实验样本取等体积混匀作为质量控制样本。所有样本保存于-80 ℃，待液相色谱-质谱联用技术（liquid chromatography-mass spectrometry， LC-MS）分析。样本分析采用液相色谱-质谱联用系统（色谱仪：Vanquish UHPLC，德国Thermo Fisher公司；质谱仪：Q ExactiveTM HF/Q ExactiveTM HF-X/Orbitrap ExplorisTM 120/ Orbitrap xplorisTM 480，美国Thermo Fisher Scientific公司）。色谱条件：色谱柱为ACQUITY UPLC BEH Amide Column （HILIC），柱温：40 ℃，流速：0.2 mL/min，流动相A：90%乙腈，5 mmol/L醋酸铵，流动相B：50%乙腈，5 mmol/L醋酸铵流动相。梯度洗脱程序如下：0~7 min，98% A；7~9 min，0% A；9~10 min，98% A。质谱条件：采用电喷雾电离（electrospray ionization， ESI）模式，同时进行正离子和负离子模式采集。扫描范围选择m/z 100~1 500；ESI 源参数设置如下：喷雾电压：3.5 kV（正离子模式）和-2.8 kV（负离子模式）；鞘气流速：35 psi； 辅助气流速：10 L/min；离子传输管温度：320 ℃；离子导入射频电平：60；辅助气加热器温度：350 ℃。MS/MS二级扫描采用数据依赖性扫描。1.2.7代谢组学数据处理与分析原始LC-MS数据文件经ProteoWizard软件转换为mzXML格式。使用XCMS进行峰提取、峰对齐和峰定量。基于保留时间、质荷比（m/z）等参数，生成代谢物定量矩阵。通过总峰面积归一化的方法实现数据矫正，以消除系统误差。代谢物鉴定与注释：代谢物主要通过精确质量数、保留时间以及二级碎片谱（MS/MS spectra）与公共数据库（HMDB、Metlin、MassBank等）进行匹配鉴定。已鉴定的代谢物使用KEGG数据库（https：//www.kegg.jp/）和LIPID Maps数据库（https：//www.lipidmaps.org/）进行注释。使用代谢组学数据处理软件metaX对数据进行初步处理。运用主成分分析（principal component analysis， PCA）和偏最小二乘法判别分析（partial least squares discriminant analysis， PLS-DA）评估组间整体代谢轮廓差异。通过PLS-DA模型计算每个代谢物的变量投影重要性（variable importance in the projection， VIP）值。单变量统计分析采用t检验计算各代谢物在两组间统计学显著性，并计算其差异倍数（fold change， FC）。为控制假阳性率，P值经过Benjamini-Hochberg法进行多重检验校正，获得校正后的错误发现率（false discovery rate， FDR）。最终筛选差异代谢物的标准为：VIP值1，校正P值（FDR）0.05，且FC1.2 或FC0.833。通路富集分析：将筛选出的差异代谢物提交至R 3.4.3、Python 3.5.0软件进行KEGG通路富集分析，以识别受影响的关键代谢通路。1.3统计学处理所有定量数据均采用GraphPad Prism 9.0 软件进行统计学处理。数据结果以平均值 ± 标准差表示。对于符合正态分布且方差齐性的两组间比较，采用t检验。对于多组间比较，采用单因素方差分析。双侧P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1L. reuteri改善CIMI小鼠的一般状况及体质量和结肠长度实验流程如图1A所示。为确认L. reuteri在小鼠肠道中的定植情况以及5-FU对其丰度的影响，采用qPCR检测小鼠粪便中的L. reuteri的相对含量。结果显示，与Control组相比，Model组小鼠粪便中L. reuteri相对丰度显著降低（LSD-t=3.508， P0.05），提示5-FU化疗可能导致肠道内L. reuteri的丰度下降（图1B），而L. reuteri治疗组小鼠粪便中L. reuteri的相对丰度较Model组升高（LSD-t=9.663， P0.001），表明灌胃后L. reuteri成功定植。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.06.015.F001图1造模流程及L. reuteri对小鼠体质量和结肠长度的影响Fig.1Modeling procedure and the effects of L. reuteri on body weight and colon length of miceA： Modeling process； B： Expression of L.reuteri in feces of mice in each group （n=5）； C-E： Body weight changes， body weight loss， colon length of mice in each group （n=6）； *P0.05， ***P0.001 vs Control group； ##P0.01， ###P0.001 vs Model group.实验过程中，Control组小鼠表现正常，形体匀称、反应灵敏、皮毛光滑柔顺、摄食及饮水情况良好、活动与精神状态正常。然而，Model组小鼠活动减少、行动迟缓、毛发杂乱，摄食及饮水减少，并伴有粪便稀软或不成形。L. reuteri治疗组小鼠的整体状态显著改善，活动度及进食量均有所增加。体质量变化结果显示，在腹腔注射5-FU前，所有实验组小鼠体质量逐渐增加。经过6天连续5-FU干预后，在第7~10天，Model组小鼠体质量较Control 组降低（LSD-t=13.01、17.51、24.56、27.54， 均P0.001）（图1C），造模结束后体质量丢失较多（LSD-t=38.22， P 0.001）（图1D）而L. reuteri治疗组的体质量下降趋势得到显著缓解（LSD-t=5.642、6.337、8.689、9.350， 均P0.001）（图1C），体质量丢失得到缓解（LSD-t=12.20， P0.001）（图1D）。此外，与Control组相比，Model组小鼠结肠长度明显缩短（LSD-t=5.873， P0.001），而L. reuteri干预后，结肠长度的缩短现象得到明显改善，显著长于Model组（LSD-t=4.417， P0.01）（图1E）。上述结果表明，L. reuteri干预可有效缓解5-FU诱导的CIMI小鼠的体质量减轻和肠道宏观损伤。2.2L. reuteri改善CIMI小鼠的肠道组织病理学形态为了评估L. reuteri对CIMI小鼠肠道病理损伤的改善作用，对各组小鼠回肠组织进行了HE染色。如图2A所示，Control组回肠绒毛形态规则，结构清晰完整，固有层未见明显炎性细胞浸润，而Model组回肠组织呈现显著病理损伤，表现为绒毛结构不完整，长度明显缩短，隐窝结构严重受损，甚至部分溶解消失（黄色箭头所示），且肠绒毛固有层可见大量炎性细胞浸润（黑色箭头所示），表明存在严重的肠道炎症和结构破坏。L. reuteri治疗组小鼠回肠的病理损伤明显减轻，表现为绒毛结构相对完整，绒毛长度有所恢复，隐窝结构损伤程度减轻，炎性细胞浸润也显著减少。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.06.015.F002图2HE染色代表性图像及绒毛-隐窝结构定量分析Fig.2HE staining images and quantitative analysis of intestinal villus-crypt structureA： Representative HE-stained images of ileal tissues from mice in each group ×30； B-D： Average intestinal villus length， average intestinal crypt height， ratio of average villus length to crypt height of mice in each group （n=4-6）； **P0.01， ***P0.001 vs Control group； #P0.05， ###P0.001 vs Model group.为了量化L. reuteri的保护作用，对回肠绒毛长度和隐窝深度进行了定量分析。结果显示， Model组小鼠的绒毛长度低于Control组（LSD-t=10.60， P0.001），而L. reuteri治疗组的绒毛长度较Model组恢复（LSD-t = 6.536， P0.001）（图2B）。如图2C所示，与Control组相比，Model组小鼠结肠隐窝高度显著降低（LSD-t=3.912， P0.01）；L. reuteri 干预后，隐窝高度较 Model 组回升（LSD-t=2.990， P0.05，）。此外，绒毛长度与隐窝深度比值（V/C比）的结果也支持了上述发现（图2D），表现为Model组V/C比值明显下降（LSD-t=10.230， P0.001），而L. reuteri治疗组的V/C比值高于Model组（LSD-t=6.370， P0.001），表明L. reuteri能有效改善CIMI小鼠的肠道形态学损伤。2.3L. reuteri促进CIMI小鼠的肠道屏障修复RT-qPCR结果显示，与Control组相比，Model组回肠中紧密连接蛋白［ZO-1（LSD-t=2.560， P0.05）、Occludin（LSD-t=2.657， P0.05）、Claudin4（LSD-t=4.118， P0.001）］和黏蛋白［Muc1（LSD-t=3.733， P0.01）、Muc2（LSD-t=3.922， P0.01）］的mRNA表达水平均明显降低。然而，L. reuteri治疗组小鼠的所有肠道屏障相关基因的mRNA表达水平均较Model组显著上调（LSD-t=2.481、3.135、2.165、2.866、2.337， P0.05），表明L. reuteri能够改善CIMI引起的肠道屏障基因表达下调（图3A-3E）。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.06.015.F003图3L. reuteri对小鼠回肠屏障功能的影响Fig.3The effects of L. reuteri on the ileal barrier function of mice A-E： The mRNA expression levels of ZO-1， Occludin， Claudin4， Muc 1 and Muc 2 in the ileal tissues of mice in each group （n=5-7）； F： Representative IHC staining images of ileal tissues from each group ×40； G，H： The relative expression intensities of ZO-1 and Occludin in IHC staining of each group （n=3）； a： Control group； b： Model group； c： L. reuteri group； *P0.05， **P0.01， ***P0.001 vs Control group； #P0.05， ##P0.01， ###P0.001 vs Model group.进一步通过免疫组织化学染色检测了回肠组织中ZO-1和Occludin蛋白的表达情况。在Control组小鼠回肠组织中，ZO-1和Occludin蛋白在肠上皮细胞膜边缘呈清晰连续的棕黄色条带状表达。在Model组小鼠中，ZO-1和Occludin表达显著减弱，呈现不连续的、弱阳性或点状染色，表明紧密连接结构遭到破坏，蛋白表达水平下降。与Model组相比，L. reuteri治疗组则小鼠回肠组织中ZO-1和Occludin的蛋白染色强度增强，表达模式也部分恢复为连续条带状（图3F）。定量分析显示，Model组ZO-1和Occludin的IOD值低于Control组（LSD-t=7.587、11.480， 均P0.001），而L. reuteri治疗组的IOD值较Model组升高（LSD-t=5.443、6.447， 均P0.01），提示L. reuteri可有效恢复CIMI小鼠回肠紧密连接蛋白的表达（图3G、3H）。2.4代谢组学分析2.4.1样本质控分析为了评估代谢组学数据采集的质量和稳定性，课题组对质量控制（quality control， QC）样本进行了相关性分析。如图4所示，在正离子和负离子模式下，所有QC样本间的Pearson相关系数均达到0.99以上（正离子模式：0.992~1.000；负离子模式：0.993~1.000）。质控样本间的高度聚集性及良好的相关性（r0.9）符合代谢组学质控标准，表明数据具有良好的重现性和可靠性，可用于后续的生物学分析。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.06.015.F004图4QC样本相关性分析Fig.4Correlation analysis of QC samplesA： Positive ion mode of samples； B： Negative ion mode of samples.2.4.2代谢物PCA结果为了初步评估各组小鼠盲肠内容物代谢谱的整体差异，进行了PCA。结果显示，在正离子模式与负离子模式下，Control组、Model组和L. reuteri治疗组的样本点在PCA得分图中均呈现出明显的分离趋势，表明各组之间存在显著的整体代谢轮廓差异（图5）。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.06.015.F005图5QC样本PCA得分图Fig.5PCA score plots of QC samplesA： Score plot in positive ion mode； B： Score plot in negative ion mode.2.4.3差异代谢物筛选与聚类分析对Control组、Model组与L. reuteri治疗组中鉴定到的所有代谢物进行分类，并绘制饼状图（图6A）。结果显示，在盲肠内容物中，占比最高的代谢物类别是脂类和类脂类（34.21%），其次是有机酸及其衍生物（20.44%）和有机杂环化合物（15.87%）。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.06.015.F006图6L. reuteri对CIMI小鼠盲肠内容物差异代谢物的影响Fig.6The effects of L. reuteri on differential metabolites in cecal contents of mice with CIMIA： Classification of metabolites； B，C： Volcano plots of differential metabolites between the L.reuteri group and the Control group； D-E： Cluster analysis of differential metabolites between the L.reuteri group and the Model group.通过PLS-DA统计分析获得的重要参数及单变量统计分析，筛选出L. reuteri治疗组与Model组之间的差异代谢物。火山图（图6B、6C）展示了正负离子模式下L. reuteri治疗组相对于Model组的差异代谢物分布。在正离子模式下，共筛选出1 050个差异代谢物，其中443个上调，607个下调。在负离子模式下，共筛选出929个差异代谢物，其中776个上调，153个下调。对这些差异代谢物进行层次聚类分析并绘制热图（图6D、6E），结果显示L. reuteri治疗组和Model组的代谢谱存在显著差异，各组样本能够根据其代谢物丰度模式进行有效区分。如表2所示，L. reuteri干预显著调节了多种代谢物的水平。其中，与Model组相比，L. reuteri治疗组小鼠盲肠内容物中的5β-胆烷酸、3，4 -二甲基- 5-戊基-2-呋喃癸酸、19（S）-羟基二十碳四烯酸、二十烯酸、（2E）-19-羟基十九碳-2-烯酸、廿四碳六烯酸、α‑甲氧基硬脂酸、胆甾烯酮、组氨酰-脯氨酰-天冬酰胺、（-）-11-羟基-9，10-二氢茉莉酮酸11-β-D-葡萄糖苷、油烯基肉碱、缩序米仔兰C、（11Z，14Z）-二十碳二烯酰肉碱、刺桐替定碱、肌酸、1-十九烷酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、N-油酰甘氨酸、异前细胞松弛素、S-烯丙基巯基尿酸的含量水平显著下调。N-（甲氧基乙酰基）-4-羟脯氨酸、20-羧基花生四烯酸、帕利噻因氨基酸、诺塞利酸B、N-甲酰基-蛋氨酸、N-L-亮氨酰基-L-异亮氨酸、L-缬氨酰基-L-丝氨酸、2，4 -二羟基十七碳-16-炔-1-基乙酸酯、苯并氨酰丙氨酸、高瓜氨酸、Nβ-富马酰胺基-L-DAP-L-缬氨酸、对羟基苯乙酰基甘氨酸、L-缬氨酰-L-苯丙氨酸的含量水平显著上调。这些被调控的差异代谢物在L. reuteri治疗CIMI过程中可能发挥重要作用。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.06.015.T002表2L. reuteri组和Model组主要差异代谢物Tab.2The main differential metabolites between the L. reuteri group and the model groupMetabolite （Chinese name）MetaboliteMolecular formulaVIPP valueTrend（vs Model）5β-胆烷酸5β-Cholanic acidC24H40O21.641.39×10-6↓N-（甲氧基乙酰基）-4-羟脯氨酸N-（methoxyacetyl）-4-hydroxyprolineC8H13NO51.722.08×10-6↑3，4-二甲基-5-戊基-2-呋喃癸酸3，4-Dimethyl-5-pentyl-2-furandecanoic acidC21H36O31.572.14×10-6↓20-羧基花生四烯酸20-carboxy Arachidonic AcidC20H30O41.253.73×10-4↑帕利噻因氨基酸PalythineC10H16N2O51.788.32×10-8↑19（S）-羟基二十碳四烯酸19S-HETEC20H32O31.481.81×10-6↓诺塞利酸BNorselic acid BC29H44O41.511.88×10-6↑N-甲酰基-蛋氨酸N-formylmethionineC6H11NO3S1.664.64×10-6↑二十烯酸Paullinic acidC20H38O21.474.93×10-6↓N-L-亮氨酰基-L-异亮氨酸H-LEU-ILE-OHC12H24N2O31.568.46×10-6↑L-缬氨酰基-L-丝氨酸ValylserineC8H16N2O41.589.85×10-6↑（2E）-19-羟基十九碳-2-烯酸（2E）-19-Hydroxynonadec-2-enoic acidC19H36O31.421.13×10-5↓廿四碳六烯酸Tetracosahexaenoic acidC24H36O21.411.28×10-5↓2，4-二羟基十七碳-16-炔-1-基乙酸酯Avocadyne AcetateC19H34O41.121.61×10-5↑苯并氨酰丙氨酸PhenylalanylalanineC12H16N2O31.571.75×10-5↑高瓜氨酸HomocitrullineC7H15N3O31.521.82×10-5↑α‑甲氧基硬脂酸2-Methoxyoctadecanoic acidC19H38O31.451.98×10-5↓Nβ-富马酰胺基-L-DAP-L-缬氨酸Dapdiamide AC12H20N4O51.562.45×10-5↑胆甾烯酮CholestenoneC27H44O1.961.98×10-6↓对羟基苯乙酰基甘氨酸p-HydroxyphenylacetylglycineC10H11NO41.963.02×10-6↑组氨酰-脯氨酰-天冬酰胺His Pro AsnC15H22N6O51.743.38×10-6↓（-）-11-羟基- 9，10-二氢茉莉酮酸11-β-D-葡萄糖苷（-）-11-Hydroxy-9，10-dihydrojasmonic acid 11-beta-D-glucosideC18H30O91.953.38×10-6↓油烯基肉碱OleylcarnitineC25H48NO41.875.00×10-6↓缩序米仔兰CAglaiabbreviatin CC24H40O21.945.03×10-6↓（11Z，14Z）-二十碳二烯酰肉碱（11Z，14Z）-EicosadienoylcarnitineC27H49NO41.657.32×10-6↓刺桐替定碱ErythratidineC19H25NO41.777.61×10-6↓肌酸CreatineC4H9N3O21.869.52×10-6↓1-十九烷酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱1-Nonadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholineC27H56NO7P1.759.61×10-6↓N-油酰甘氨酸N-oleoyl glycineC20H37NO31.711.12×10-5↓L-缬氨酰-L-苯丙氨酸L-Valyl-L-phenylalanineC14H20N2O31.491.18×10-5↑异前细胞松弛素Iso-precytochalasinC28H33NO41.631.28×10-5↓S-烯丙基巯基尿酸S-Allylmercapturic acidC8H13NO3S1.682.40×10-7↓2.4.4差异代谢物的KEGG分析为深入阐明L. reuteri对CIMI小鼠肠道代谢的影响机制，本研究对筛选出的差异代谢物进行了KEGG通路富集分析。首先，基于KEGG数据库对正负离子模式下的差异代谢物进行分类分析，结果如图7A和7B所示，主要集中在氨基酸代谢、脂质代谢、核苷酸代谢以及其他次生代谢产物生物合成等大类。LIPID MAPS对脂质差异代谢物进行了更详细的分类注释（图7C、7D），结果显示多种胆汁酸和脂肪酸等与肠道菌群密切相关的脂质代谢物发生了显著改变。这些结果揭示了L. reuteri干预后小鼠盲肠内容物的代谢发生广泛变化。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.06.015.F007图7差异代谢物的KEGG通路富集分析Fig.7KEGG analysis of differential metabolites A，B： Classification analysis of differential metabolites in positive （A） and negative （B） ion modes； C，D： LIPID MAPS classification annotation in positive （C） and negative （D） ion modes； E： KEGG enrichment bubble plot of differential metabolites between the L. reuteri group and the Model group.KEGG通路富集分析结果显示L. reuteri治疗组与Model组之间的差异代谢物显著富集于多个关键代谢通路（图7E）。其中，与脂质代谢相关的通路包括亚油酸代谢、不饱和脂肪酸的生物合成等。此外，还富集到氨基酸代谢相关通路，如色氨酸代谢、D-氨基酸代谢等。更为重要的是，富集分析也揭示了与肠道炎症、细胞损伤及修复，以及宿主生理功能调控密切相关的通路，如细胞色素P450药物代谢、坏死性凋亡、铁死亡、氨基糖和核苷酸糖代谢、卵巢类固醇生成等。这些被调控的关键代谢通路及其中的差异代谢物，共同提示了L. reuteri在缓解CIMI中的多重潜在作用机制。3讨论化疗作为恶性肿瘤治疗的基石，常伴随CIMI这一严重并发症，显著影响患者的生活质量和治疗依从性。CIMI与肠道菌群及其代谢产物紊乱密切相关［12–13］。肠道菌群衍生的代谢物在维持肠道稳态、保护肠上皮屏障功能中发挥着重要作用［14］。因此，通过调节肠道菌群或补充益生菌以缓解CIMI，已成为当前研究热点［15–17］。L. reuteri作为一种重要的益生菌，具有免疫调节、抗炎、改善代谢等多种生物学功能。尽管已有研究提示L. reuteri可能对多种肠道疾病具有保护作用［18］，但其通过调节宿主-微生物代谢轴缓解CIMI作用机制，仍有待深入阐明。本研究利用5-FU诱导的CIMI小鼠模型，结合非靶向代谢组学技术，全面解析了L. reuteri对CIMI的保护作用及其对肠道代谢谱的调控效应，系统揭示其缓解CIMI的潜在机制。L. reuteri干预有效改善了CIMI小鼠体质量下降和结肠长度缩短情况，提示L. reuteri具有整体保护作用。HE分析显示，5-FU导致的肠绒毛缩短在L. reuteri治疗后得到显著改善，表明L. reuteri能够促进受损肠道黏膜的结构和功能恢复。CIMI的核心病理特征之一是肠道屏障功能受损，导致“肠漏”现象，进而引发炎症反应并加剧全身性并发症［19］。本研究通过RT-qPCR和IHC检测发现，5-FU显著下调了ZO-1、Occludin、Claudin4、Muc1和Muc2的表达，L. reuteri干预能够显著逆转这些屏障功能相关分子的表达下降，提示其增强肠道紧密连接和黏液屏障的完整性。为了深入探究L.reuteri作用的代谢调控网络，对小鼠盲肠内容物进行非靶向代谢组学分析。PCA分析显示，Model组与Control组的代谢谱存在显著差异，而L. reuteri组的代谢谱则呈现向Control组回归的趋势，这提示5-FU诱导了明显的肠道代谢紊乱，而L. reuteri能够有效纠正这些代谢异常。值得注意的是，差异代谢物筛选和KEGG通路富集分析揭示了脂质代谢和氨基酸代谢在L. reuteri缓解CIMI中具有重要作用。已有研究［20］报道酰基肉碱水平的升高在体外和炎症性肠病小鼠肠道中均可促进致病生物体的生长。本研究结果显示，Model组小鼠盲肠内容物中油烯基肉碱、（11Z，14Z）-二十碳二烯酰肉碱等酰基肉碱水平显著升高，而L. reuteri干预后其水平下调，提示L. reuteri可能通过降低有害酰基肉碱水平，改善微生态环境。此外，虽然某些多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids， PUFAs）具有抗炎作用，但过量或失衡的PUFAs代谢产物也可能会诱导内质网应激，驱动肠道炎症的发生［21］。炎症性肠病者粪便中常伴有PUFAs水平升高［22］。本研究中，L. reuteri给药后，盲肠内容物中19 （S）-羟基二十碳四烯和廿四碳六烯酸等PUFAs呈现下降趋势。这一结果提示，L. reuteri可能通过降低其水平，恢复脂质代谢平衡。KEGG通路富集分析进一步揭示，亚油酸代谢等脂质代谢通路显著富集，进一步印证了L. reuteri对肠道脂质代谢重编程的广泛影响。在氨基酸代谢方面，L. reuteri在色氨酸代谢通路显著调节。肠道菌群在色氨酸代谢中发挥关键作用，其代谢产物如吲哚衍生物等对肠道免疫和屏障功能有重要影响。L. reuteri可能通过调节色氨酸向这些有益代谢物的转化，或减少有害代谢物的产生。尽管本研究为L. reuteri改善CIMI提供了多方面证据，仍存在一些局限性。首先，本研究中IHC样本量为3，后续研究可在更大样本量下进一步验证。此外，本研究揭示了L. reuteri调节的关键代谢物和通路，但未能深入验证这些关键代谢物的直接作用。后续需通过补充外源性代谢物等实验，进一步明确这些代谢产物在L. reuteri保护作用中的具体机制。