结肠癌是全球高发的恶性肿瘤之一，流行病学数据显示其患病率排名第三，致死率高居第二［1］。近年来，众多中药及中药单体化合物，如多糖、生物碱和类黄酮等都被证实具有显著的抗肿瘤作用［2］。生物碱作为天然药物的重要类别之一，已被大量研究证实其对肿瘤有较好的治疗效果，如Ishii et al［3］研究显示康奎宁对肿瘤相关成纤维细胞的活性有显著抑制作用；Zhang et al［4］研究报道称蝙蝠葛碱可通过内源性途径诱导肾癌细胞凋亡；长春新碱被证实可与微管蛋白纤维结合从而抑制微管聚合，最终抑制肿瘤细胞的有丝分裂［5］。木兰花碱（magnoflorine，Mag）作为生物碱的一类，广泛存在于小檗科、木兰科、罂粟科等多种药用植物中［6］，其药理作用被报道包含抗炎、抗氧化与免疫调节等［7］，然而截至目前Mag在结肠癌中的功能与机制尚不完全清楚，亟待深入探讨。因此，该研究旨在系统探究Mag对结肠癌细胞的抑制作用及潜在分子机制，丰富其药理活性认知，为结肠癌治疗策略的开发提供新思路与理论依据。1材料与方法1.1细胞人结肠癌细胞系SW620和HCT116来源于上海生物科学研究所。1.2药物、试剂与仪器Mag（纯度98%）购自上海阿拉丁公司；L-15培养基、DMEM培养基购自武汉博士德公司；CCK-8试剂盒（货号：C0038）购自上海碧云天公司；结晶紫染液（货号：G1062）购自北京索莱宝公司；EdU增殖试剂盒（货号：C00003）购自广州市锐博公司；Transwell小室（货号：14341）购自北京兰杰柯公司；抗体增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen， PCNA）、基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9， MMP9）、细胞癌基因Myc（cellular myelocytomatosis oncogene， c-Myc）（货号：SC-56、SC-13520、SC-40）购自美国Santa公司；抗体细胞周期蛋白D1（cyclin D1）（货号：WL01435a）购自沈阳万类公司，抗体信号转导及转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3， STAT3）、磷酸化STAT3（phospho-STAT3， p-STAT3）、上皮钙黏蛋白（epithelial cadherin， E-cadherin）、锌指转录因子Slug（Slug）、波形蛋白（Vimentin）（货号：9139T、9131S、3195T、9585T、5741T）购自美国CST公司。酶标仪（美国Spectra-Physics公司，型号：SpectraMax i3x），荧光倒置显微镜（日本Olympus公司，型号：IX73），低温高速离心机（德国Eppendorf公司，型号：5804R）。1.3Mag的作用靶点预测通过Pubchem数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）获取Mag的SMILES号，导入Swiss Target Prediction药物靶点预测网站（https：//swisstargetprediction.ch/），分析Mag可能的作用靶点。1.4结肠癌疾病靶点基因的获取通过整合多个生物信息学数据库，系统筛选了结肠癌的潜在作用靶点。分别检索了GeneCard（https：//genecards.org/）、OMIM（https：//www.omim.org/）以及DisGeNET（https：//www.disgenet.com/）三大数据库，从中获取与结肠癌发生发展相关的潜在靶点并进行整合，剔除其中存在的重复条目即得到结肠癌疾病靶点数据集。1.5“药物-疾病”共同靶点网络的构建采用Venny 2.1.0在线工具（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）对Mag的作用靶点与结肠癌相关疾病靶点进行系统性的交集分析，旨在识别出二者共同作用的关键靶标。随后将筛选的共同靶点导入STRING数据库（https：//cn.string-db.org/），构建蛋白-蛋白网络互作（protein-protein interaction， PPI）网络模型，以揭示这些靶点的潜在关系。为进一步提升网络结构的可视化效果，利用Cytoscape 3.10.2软件对PPI网络进行可视化处理与图形优化。1.6KEGG和GO富集分析将Mag作用靶点与结肠癌疾病靶点的共同靶点导入DAVID分析平台（https：//david.ncifcrf.gov/），采用超几何分布检验，P0.05作为统计学标准，利用微生信在线分析平台（http：//www.bioinformatics.com.cn/）对共同靶点进行KEGG通路与GO功能富集分析，并进行可视化处理。1.7分子对接首先，从蛋白质结构数据库RCSB PDB（https：//www.rcsb.org/）中，筛选并下载目标靶点蛋白的最适三维结构文件（PDB格式）。并从PubChem化学数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中获取Mag的二维化学结构信息。随后采用AutoDock 3.10.2分子对接软件，对目标靶点蛋白与Mag进行分子对接模拟，以探究二者间的相互作用模式及结合亲和力，并利用PyMOL分子可视化软件对靶点-药物复合物的三维空间构象进行立体可视化分析与展示，进一步将对接结果导入LigPlus，生成详细的二维相互作用平面图，以直观呈现氢键、疏水作用等关键结合特征。1.8CCK-8实验以每孔1×104个细胞的密度将结肠癌细胞系HCT116与SW620接种于96孔板中，待细胞贴壁后分别加入不同浓度（0、0.01、0.02、0.04、0.08、0.16、0.32、0.64、0.80 mmol/L）梯度的Mag处理，随后参照试剂盒说明书进行细胞活性检测，弃去原有培养基，每孔更换为100 µL预先配制好的含10% CCK-8试剂的完全培养基，于培养箱中避光孵育1 h，随后在450 nm波长下测定吸光度值。1.9细胞克隆形成实验于6孔板中以500个/孔的密度接种细胞，随后于培养箱中连续培养14 d，以确保单个细胞充分增殖并形成克隆。用PBS冲洗多余的细胞碎片，用4%多聚甲醛固定40 min随后用0.1%结晶紫溶液染色40 min，PBS洗涤3次，待干燥后进行计数并拍照记录。1.10EdU增殖测定将细胞以每孔4×103个的密度接种于24孔板中培养24 h，参照试剂说明书方法，将细胞与50 µmol/L EdU在37 °C条件下共孵育2 h。随后，使用4%多聚甲醛溶液于室温固定细胞30 min。去除固定液后，加入2 mg/mL甘氨酸溶液以中和残留的醛基。接着PBS洗涤细胞3次，每次5 min。洗涤步骤完成后，向每孔中加入适量渗透剂（含0.5% Triton X-100的PBS），室温孵育10 min后将孔内渗透剂弃去，随后向各孔中加入Apollo染色反应液，于室温条件下处理细胞30 min，处理结束后以渗透剂清洗2~3次。细胞核染色采用Hoechst 33342，染色30 min。最后，每孔加入PBS并于4 ℃ 条件下保存，等待后续检测。1.11细胞划痕试验在6孔板中培养细胞，待细胞分布均匀且密度达到约95%后使用无菌枪头尖端垂直划下单一线条，用PBS洗涤去除细胞碎片并将细胞置于无血清培养基中，在37 °C、5% CO2条件下培养，使用显微镜在划痕后不同时间点观察和拍摄图像。1.12Transwell 检测在Transwell上室接种含1×10⁵个细胞的无血清均匀悬液，下室加入600 µL含20%血清的完全培养基作为趋化剂，随后置于37 °C、5% CO₂培养箱中孵育48 h。迁移结束后，用PBS洗涤2次，依次经4%多聚甲醛固定40 min和0.1% 结晶紫染色30 min，最后于显微镜下观察并拍摄图像来统计细胞迁移数量进行分析。1.13Western blot收集的细胞用PBS洗涤后，采用RIPA蛋白裂解缓冲液进行裂解，裂解液经离心（12 000 r/min）取上清液，测定蛋白浓度后制样备用，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳对蛋白质样品进行分离，通过湿转将凝胶中分离的蛋白质条带转印至PVDF膜上，然后用5%脱脂牛奶室温条件下封闭1 h，封闭完成后将膜在4 °C条件下与相应一抗Slug （1∶1 000）、Vimentin （1∶1 000）、E-cadherin（1∶1 000）、MMP9（1∶1 000）、c-Myc（1∶1 000）、PCNA（1∶1 000）、Cyclin D1（1∶1 000）、p-STAT3（1∶1 000）、STAT3（1∶1 000）和Tubulin（1∶5 000）孵育过夜，其中EMT相关蛋白包括E-cadherin、Slug和Vimentin。次日用TBST洗涤3次后，将PVDF膜与相应二抗（羊抗兔和羊抗鼠辣根过氧化物酶标记的IgG二抗，1∶4 000）在室温条件下孵育1 h，最后将膜与ECL底物反应液均匀接触后进行显影。1.14统计学处理使用GraphPad Prism 10软件进行统计分析，每个实验独立重复3次，两组间差异采用独立样本t检验分析，多组间比较采用单因素方差分析，事后两两比较采用Dunnett-t检验，P0.05 为差异有统计学意义。2结果2.1Mag与结肠癌的共同靶点筛选及PPI网络构建首先，通过TCMSP数据库获取Mag的结构式（图1A），利用Swiss Target Prediction数据库筛选获得Mag潜在作用靶点108个；在DisGeNET数据库筛选出结肠癌相关靶点31个，在OMIM数据库中筛选得到结肠癌相关靶点505个，Genecards数据库筛选得到结肠癌相关靶点2 000个，将这3个数据库的靶点合并并删除重复靶点后共得到2 355个疾病相关靶点。将上述的108个Mag的作用靶点与2 355个结肠癌相关靶点输入Venny 2.1.0软件分析得到44个交集靶点，即为Mag调控结肠癌的潜在靶点（图1B）。将上述的44个交集靶点导入到String数据库即获得Mag-结肠癌共同靶点的PPI图（图1C），并导入Cytoscape 3.10.2软件将其可视化，利用Degree值由大到小排列筛选与Mag互作的核心靶点，得到PPI网络图同心圆结构（图1D），排名前五的靶点依次是STAT3、表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor， EGFR）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（cysteinyl aspartate specific protease 3， CASP3）、MMP9和肉瘤基因酪氨酸蛋白激酶（SRC proto-oncogene， non-receptor tyrosine kinase， SRC），见表1。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.06.007.F001图1Mag-结肠癌共同靶点网络构建Fig. 1Network construction of common targets for mag-colon cancerA： Chemical structure of magnoflorine； B： Venny diagram of mag targets and colon cancer-related targets； C： PPI network of common targets of mag and colon cancer； D： Visualization of the PPI network of common targets of mag and colon cancer.10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.06.007.T001表1PPI 网络中Degree值排名前5位的核心靶点Tab.1Top 5 targets in terms of degree value in the PPI networkNameDegreeClosenessBetweennessSTAT3340.811 320 7550.077 474 049EGFR330.796 296 2960.078 729 484CASP3330.796 296 2960.061 883 601MMP9310.767 857 1430.077 066 214SRC290.741 379 3100.079 441 9982.2GO功能分析和KEGG通路分析为了探究Mag抵抗结肠癌的潜在机制，将Venny分析得到的44个交集靶点输入至DAVID数据库进行分析。GO功能富集结果显示，Mag抵抗结肠癌的生物学过程（biological process，BP）主要集中在磷酸化、细胞增殖、细胞迁移和激酶活性调节等；分子功能（molecular function，MF）主要集中在ATP结合和血管内皮生长因子结合等方面；细胞成分（cellular component，CC）则主要包含有胞浆、细胞质、细胞核、细胞质膜等（图2A）。KEGG富集分析结果显示，Mag抵抗结肠癌主要涉及Janus激酶-信号转导和转录激活因子通路（janus kinase-signal transducer-activator of transcription pathway， JAK-STAT），腺苷酸活化蛋白激酶通路［adenosine 5'-monophosphate （AMP）-activated protein kinase， AMPK］以及B细胞受体信号通路等（图2B）。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.06.007.F002图2Mag-结肠癌共同靶点的GO功能和KEGG富集分析Fig.2GO functional and KEGG enrichment analysis of common targets for mag-colon cancerA： GO functional analysis results of common targets of mag and colon cancer； the top ten items in each branch of BP， CC and MF； B： KEGG enrichment analysis results of common targets of mag and colon cancer； the top fifteen signaling pathways were shown.2.3分子对接为了评估Mag-结肠癌共同靶点PPI网络中排名靠前的核心靶点与Mag的结合活性，将Mag和PPI网络中按Degree值由大到小排名前5位的靶点STAT3、EGFR、CASP3、MMP9和SRC分别进行分子对接，Mag与各靶点的结合度可以通过结合能的高低预判，结合能越低预示着Mag与靶点之间的结合越稳定。分子对接结果显示，Mag与STAT3、MMP9、EGFR、CASP3和SRC的结合能依次为-8.50 kcal/mol、-9.56 kcal/mol、-6.39 kcal/mol、-5.84 kcal/mol和-6.13 kcal/mol。随后利用PyMOL软件将以上分子对接结果分别进行可视化，并使用Ligplus软件获取相应对接结果的平面2D图（图3）。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.06.007.F003图3Mag-结肠癌共同核心靶点的分子对接可视化结果Fig.3Visualization of molecular docking results for mag and common core targets in colon cancerA-E： 3D and 2D representations of molecular docking of mag with STAT3， MMP9， EGFR， CASP3 and SRC mag.2.4Mag对结肠癌细胞活力及细胞增殖的影响为了评估Mag对结肠癌细胞增殖的影响，分别以不同浓度的Mag处理HCT116和SW620两种结肠癌细胞，随后通过CCK-8实验对Mag处理不同时间（24、48和72 h）后的结肠癌细胞的细胞活力进行检测，结果显示随Mag药物浓度升高，HCT116和SW620两种结肠癌细胞的细胞活力均显著下降（趋势性方差检验：F24 h=150.200、60.790，F48 h=299.200、202.100，F72 h=856.700、1 661.000，均P0.05）（图4），结合CCK-8实验结果，本研究选择采用0.80 mmol/L的Mag进行后续实验。细胞克隆形成实验结果显示，Mag处理组HCT116和SW620细胞克隆数量与对照空白处理组相比明显减少（t=13.290、5.462，均P0.01）（图5A）；EdU实验结果显示Mag处理组与对照空白处理组相比细胞增殖能力明显下降（t=9.475、23.280，均P0.001）（图5B）。Western blot检测结果显示Mag处理组与对照空白处理组相比细胞增殖相关分子c-Myc、Cyclin D1和PCNA的蛋白表达水平降低（tc-Myc=7.295、15.340，tCyclin D1=24.010、8.898，tPCNA=15.370、10.300，均P0.01）（图5C）。上述结果表明Mag可以显著抑制结肠癌细胞的增殖。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.06.007.F004图4Mag对结肠癌细胞活力的影响 （n=3）Fig. 4The effects of mag on viability of colon cancer cells （n=3） CCK-8 assay was used to examine the cell viability of HCT116 and SW620 colon cancer cells treated with different concentrations of mag after 24， 48， or 72 hours； *P0.05， **P0.01， ***P0.001 vs 0 mmol/L group.10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.06.007.F005图5Mag对结肠癌细胞增殖的影响 （n=3）Fig. 5The effects of mag on proliferation of colon cancer cells （n=3）A： Colony formation assay was conducted to evaluate the colony formation ability in HCT116 and SW620 colon cancer cells treated with mag or negative control； B： EdU assay was performed to detect the proliferation of HCT116 and SW620 colon cancer cells treated with mag or negative control ×200； C： Western blot was performed to detect the expression of c-Myc， Cyclin D1， and PCNA in HCT116 and SW620 colon cancer cells treated with mag or negative control； ##P0.01， ###P0.001 vs Ctrl group.2.5Mag对结肠癌细胞迁移的影响细胞划痕实验结果显示，与对照组相比，Mag显著降低了两种结肠癌细胞的细胞迁移能力（t48 h=8.586、3.486，t72 h=25.69、10.54，均P0.05）（图6A）。Transwell实验结果同样显示，与对照组相比，Mag处理后显著抑制了结肠癌细胞的迁移（t=11.61、23.84，均P0.001）（图6B）。为了评估Mag对结肠癌细胞迁移运动的影响，本研究通过Western blot实验检测了EMT相关蛋白E-cadherin、Slug、Vimentin以及基质金属蛋白MMP9的表达情况，实验结果显示，相较于对照空白处理组，Mag处理组结肠癌细胞EMT相关标志物（Slug、Vimentin、MMP9）的蛋白表达显著下调（tSlug=14.330、9.542，tVimentin=4.727、4.969，tMMP9=3.177、9.658，均P0.05），而上皮标志物E-cadherin的表达则显著上调（t=6.226、7.413，均P0.01）（图7）。以上研究结果表明Mag可显著抑制结肠癌细胞的迁移。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.06.007.F006图6Mag对结肠癌细胞迁移能力的影响 （n=3）Fig.6The effects of magnoflorine on the mag ability of colon cancer cells （n=3）A： Cell scratch assay was used to evaluate the migration ability of HCT116 and SW620 colon cancer cells treated with mag or negative control ×40；B： Transwell assay was used to evaluate the migration ability of HCT116 and SW620 colon cancer cells treated with mag or negative control ×100； *P0.05， **P0.01， ***P0.001 vs Ctrl group.10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.06.007.F007图7Mag对结肠癌细胞中EMT相关蛋白的影响 （n=3）Fig.7The effects of mag on EMT-related proteins of colon cancer cells （n=3）*P0.05， **P0.01， ***P0.001 vs Ctrl group.2.6Mag可通过抑制JAK-STAT3信号通路抵抗结肠癌KEGG富集分析结果初步显示JAK-STAT信号通路可能是Mag抵抗结肠癌的关键信号通路之一，因此本研究进一步在结肠癌细胞HCT116和SW620中验证Mag对JAK-STAT信号通路关键蛋白的影响。Western blot检测结果显示，与对照空白处理组相比，Mag处理组结肠癌细胞中p-STAT3蛋白表达水平显著降低（t=7.455、5.406，均P0.01）（图8），这表明Mag通过一定程度抑制JAK-STAT3信号通路在结肠癌中发挥功能。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.06.007.F008图8Mag对JAK-STAT3信号通路的影响 （n=3）Fig.8The effects of mag on the JAK-STAT3 signaling pathway （n=3）**P0.01 vs Ctrl group.3讨论结肠癌是一种高病死率的全球性疾病，其发病率和病死率呈急剧上升的趋势［8］。植物天然提取物生物碱在调节肿瘤发生发展方面显示出重要作用［9］，Mag作为重要的生物碱之一，已被报道可以协同阿霉素抑制乳腺癌细胞的迁移和侵袭［10］；此外Mag还被证实以剂量依赖性方式抑制骨肉瘤细胞的活力、侵袭和EMT，进而提高了骨肉瘤细胞对顺铂的药物敏感性［11］。关于Mag在结肠癌中的作用及机制尚不完全清楚，本研究结合网络药理学及细胞实验探究Mag在结肠癌中的作用及相关机制。通过网络药理学初步分析发现Mag与核心靶点STAT3、MMP9结合较稳定，同时KEGG富集分析筛选得到JAK-STAT信号通路可能是Mag抵抗结肠癌的关键信号通路之一。本研究进一步通过细胞实验验证Mag抵抗结肠癌的靶点和作用机制，发现Mag可以显著抑制结肠癌细胞活力以及抑制增殖情况，Western blot实验结果显示Mag显著抑制结肠癌细胞中增殖相关蛋白c-Myc、Cyclin D1和PCNA的表达，这些均表明Mag对结肠癌细胞的增殖具有抑制作用。肿瘤细胞的迁移能力是其恶性表型的重要体现，EMT在赋予肿瘤细胞迁移与侵袭能力中起到关键作用，因此，靶向干预EMT已成为阻断肿瘤转移的重要策略。Slug作为EMT的核心转录因子通过抑制上皮标志物E-cadherin的转录，从而使细胞间黏附受到破坏并诱导间充质标志物Vimentin表达进而使细胞骨架重组，最终导致肿瘤细胞迁移和侵袭能力增强［12］。此外，基质金属蛋白酶MMP9也是EMT中促进肿瘤细胞迁移的关键因子。既往研究［13］证明蛋白磷酸5催化亚基（protein phosphatase 5 catalytic subunit， PPP5C）可通过正向调控MMP9促进肺腺癌H1299细胞的迁移，此外亦有研究［14］表明hsa_circ_0009128通过靶向MMP9激活EMT过程进而刺激口腔鳞癌细胞的增殖和迁移，本研究网络药理学分析结果发现Mag与MMP9具有较高的结合活性，这就提示MMP9可能是Mag发挥生物学效应的另一潜在重要靶点。同时本研究细胞划痕实验、Transwell实验均证实Mag显著抑制了结肠癌细胞的迁移能力，Western blot实验结果显示Mag显著抑制Slug、Vimentin和MMP9蛋白的表达，而上皮细胞标志物E-cadherin的蛋白表达水平在Mag处理组结肠癌细胞中显著升高，提示Mag可通过抑制结肠癌细胞的迁移运动从而抑制结肠癌细胞的恶性行为。本研究通过Western blot实验，表明Mag可以抑制结肠癌细胞中p-STAT3的表达，由此可知Mag对结肠癌细胞增殖与迁移的抑制作用，可能与其一定程度抑制JAK-STAT3信号通路的激活有关。本研究现阶段通过“网络药理学-分子对接-体外细胞实验”初步探究Mag抵抗结肠癌的作用及潜在靶点，未来将进一步开展Mag抵抗结肠癌相关的体内动物实验，深入探究Mag在复杂肿瘤微环境中抗癌作用及相关分子机制。