中国前列腺癌（prostate cancer， PCa）发病率近年来持续升高，且多数患者确诊时已为晚期，临床诊疗与防控形势严峻［1–2］。去势抵抗性前列腺癌（castration resistance prostate cancer， CRPC）标志着PCa已进入进展性且致死性的晚期阶段［3］。现阶段去势治疗和雄激素受体（androgen receptor，AR）相关的靶向治疗对PCa患者至关重要［4］。研究［5］表明，血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor， VEGF）在PCa组织中显著上调，其异常表达与肿瘤侵袭、转移及不良预后密切相关。哺乳动物不育系20样激酶1（mammalian sterile 20 like kinase 1， MST1）是Ste-20激酶家族的关键成员，作为Hippo信号通路的核心组成部分，调控细胞增殖、凋亡、自噬及肿瘤发生［6–7］。Hippo信号通路的失调已被证实参与多种肿瘤的血管生成过程，而VEGF作为关键的促血管生成因子，其表达受到多条信号通路的调控。然而，关于MST1对CRPC细胞的血管生成及对AR的调控尚不明确。本研究旨在探讨MST1在PCa组织中的表达模式、其对细胞增殖、迁移及血管生成的影响，以及MST1对AR及VEGF表达的调控作用，为PCa的分子机制研究和靶向治疗策略的开发提供新的实验依据。1材料与方法1.1病例资料收集2015年1月至2022年7月安徽医科大学第一附属医院病理科的77例PCa组织样本和34例前列腺良性增生（benign prostatic hyperplasia， BPH）组织样本。纳入标准为经病理学确诊的PCa患者，且患者都是在未经过治疗的情况下获得的手术切除标本，具有完整的临床及病理信息。排除接受过新辅助治疗、合并其他恶性肿瘤或临床资料不全的患者。所有组织样本均具有完整的临床及病理信息，包括年龄、前列腺特异性抗原（prostate specific antigen， PSA）水平、TNM临床分期、Gleason评分及转移状态。转移状态的判定基于影像学检查（CT、MRI或骨扫描）结合临床随访记录，转移部位主要包括骨、淋巴结及其他远处器官。本研究经安徽医科大学生物医学伦理委员会批准（伦理审批号：20190406）。1.2免疫组化分析组织切片浸泡在二甲苯中以去除石蜡，随后用乙醇进行水化处理。高温高压下使用枸橼酸溶液进行热诱导抗原修复。利用3% H2O2在室温下阻断内源性过氧化物酶活性。切片在4 ℃下与抗MST1抗体（美国 Abcam公司，货号：ab51134；稀释度1∶100）孵育过夜。二抗37 ℃下孵育30 min。阳性判定标准为：超过50%的细胞显示明确的阳性染色。1.3细胞培养与构建正常前列腺上皮细胞RWPE-1和早期雄激素依赖性前列腺癌细胞LNCaP购自中国科学院细胞库。晚期CRPC细胞C4-2和晚期CRPC细胞22RV1由安徽医科大学第一附属医院泌尿外科提供。RWPE-1细胞在含有庆大霉素/两性霉素溶液（500×，美国Gibco公司，货号：R-015-10）和K-SFM培养基（美国Invitrogen公司，货号：17005-042）中培养。PCa细胞系在含有10%胎牛血清（以色列BI公司，货号：04-001-01A）和1%青-链霉素溶液的RPMI-1640培养基（美国HyClone公司，货号：SH30096.01）中培养。MST1基因的化学合成由上海GenePharma公司完成。实验分组包括空白对照组（未转染）、空载体对照组（转染pcDNA3.1空载体，标记为Vector组）和MST1过表达组（转染pcDNA3.1-MST1质粒，标记为MST1组）。转染前24 h将细胞接种于6孔板，待细胞密度达到70%~80%时，使用LipofectamineTM 2000（美国Invitrogen公司）按照说明书进行质粒转染。转染36 h后收集细胞，通过qRT-PCR和Western blot验证过表达效果，确认转染效率后进行后续功能实验。1.4qRT-PCR检测使用TRIzol试剂（美国Invitrogen公司）提取PCa细胞的总RNA，并使用PrimeScript RT Master Mix（日本Takara公司，货号：RR036A）将RNA逆转录为cDNA。PCR体系的组成如下：SYBR Premix 10 μL，上下游引物各0.8 μL，ROX Reference DyeⅡ（50×）0.4 μL，模板2 μL，ddH2O 6 μL，总体积20 μL。温度程序为：95 °C 30 s；95 °C 5 s，60 °C 34 s，40个循环。GAPDH上游引物5'-CATGAGAAGTATGACAACA GCCT-3'，下游引物5'-AGTCCTTCCACGATACCAA AGT-3'；MST1上游引物5'-ACAAATCCTCCTCCC ACATTCCG-3'，下游引物5'-CACTCCTGACAAAT GGGTGCTG-3'；VEGF上游引物5'-GAGCCTTGC CTTGCTGCTCTAC-3'，下游引物5'-CACCAGGGT CTCGATTGGATG-3'；AR上游引物5'-GGAATTCC TGTGCATGAAA-3'，下游引物5'-CGAAGTTCAT CAAAGAATT-3'。所有引物购自上海Sangon公司。1.5Western blot分析向裂解液中加入蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂和RIPA缓冲液，按1∶1∶100的比例混合，并在冰上刮取细胞。样品加载到7.5%的聚丙烯酰胺凝胶上，进行电泳分离，随后转移到硝酸纤维素膜（美国GE Healthcare公司）。膜用5%脱脂奶粉封闭2 h，并在4 ℃下与一抗孵育12~16 h。主要抗体如下：GAPDH抗体（美国ProteinTech公司，货号：10，494-1-AP稀释度1∶1 000），MST1抗体（美国Abcam公司，货号：#ab51134，稀释度1∶10 000），VEGF抗体（美国Abcam公司，货号：# ab214424，稀释度1∶1 000），AR抗体（美国CST公司，货号：5153 S，稀释度1∶2 000）。清洗膜以去除未结合的一抗，然后在室温下与HRP标记的山羊抗兔IgG（美国Proteintech公司，货号：SA00001-2，稀释度：1∶5 000）孵育1 h后，使用ECL（上海欧翔科学仪器有限公司 Bioshine ChemiQ系列）显影条带。1.6细胞增殖实验将细胞以3 000个/孔的密度接种于96孔板中。分别在培养24、48、72和96 h后，更换新鲜培养基，并将其放置在避光环境中。小心地将10 μL CCK-8溶液加入至每孔中，继续在温箱中孵育2 h。使用武汉优尔生SMR16.1智能微孔板酶标仪在450 nm波长下测量吸光度值。1.7Transwell迁移实验将细胞用无血清培养基（美国HyClone公司，货号：SH300027.01）重悬成1×105个/mL的细胞悬液，在24孔板中加入500 μL含20%FBS的完全培养基（美国HyClone公司，货号：SH300027.01），并将洗净的小室轻柔地放入24孔板（安徽欣乐生物技术有限公司，货号：XL-2401）内；在Transwell小室的上室中加入200 μL的无血清细胞悬液后将板放入温箱（上海一恒科学仪器有限公司，货号：BPN-80CH）中培养24 h；将小室放入结晶紫溶液中染色；随后洗净小室并擦除上室内侧的细胞，最后将小室放在干净的载玻片上，在显微镜（日本OLYMPUS公司，型号：CKX41-A32PH）下对小室外侧进行拍照。1.8血管生成实验人脐静脉内皮细胞（HUVEC）购自中国科学院细胞库，在含有10%胎牛血清和内皮细胞生长添加剂的ECM培养基（美国ScienCell公司，货号：1001）中培养。实验前24 h将转染后的C4-2细胞（包括Vector组和MST1组）接种于6孔板，待细胞生长至80%融合度时，更换为无血清RPMI-1640培养基继续培养24 h，收集细胞上清液并经0.22 μm滤器过滤后使用。将96孔板预先在4 ℃冷却，次日向每孔加入50 μL基质胶（美国Corning公司，货号：#356234），随后立即置于37 ℃温箱中孵育30 min直至基质胶凝固。消化收集HUVEC细胞，用C4-2细胞的上清液重悬至细胞浓度为3×104个/mL，向每孔中加入100 μL细胞悬液。将细胞置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，使用倒置显微镜（日本OLYMPUS公司，型号：CKX41-A32PH）在2、4、6、8、12和24 h分别观察并拍摄新毛细血管样管腔结构的形成情况。使用ImageJ软件测量新毛细血管样管腔结构的总长度，每组设置3个重复孔，实验重复3次。1.9统计学处理使用GraphPad Prism 8.0对数据进行统计学分析并绘制柱状图。每组实验均重复3次，实验数据以x¯±s或n （%）表示，两组间比较采用独立样本t检验或χ2检验，临床病理特征的组间比较采用χ2检验或Fisher确切概率检验。多组间比较采用单因素方差分析，对于重复测量数据（如不同时间点的细胞增殖实验）采用Two-way ANOVA分析评估组间差异及时间效应。P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1MST1在PCa和良性BPH组织中的表达通过免疫组化技术分析了77例PCa组织样本（其中包括71例无转移和6例有转移）及34例BPH组织样本中的MST1表达（图1），免疫组化结果显示MST1主要在细胞质中表达。表1的结果显示，在34例BPH样本中，30例MST1呈阳性，阳性率为88.24%，而在77例PCa组织中，MST1阳性率仅为64.94%，差异有统计学意义（P0.05）。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.06.009.F001图1MST1 在前列腺组织中的表达Fig.1The expression of MST1 in prostate tissuesA： MST1 was negatively expressed in BPH tissues； B： MST1 was positively expressed in BPH tissues； C： MST1 was negatively expressed in PCa tissues； D： MST1 was positively expressed in PCa tissues.10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.06.009.T001表1MST1在PCa和良性前列腺增生组织中的表达 ［n （%）］Tab. 1The expression of MST1 in prostate cancerand benign prostatic hyperplasia tissues ［n （%）］GroupnNegative MST1 expressionPositive MST1 expressionχ2 valueP valueBenign prostate344 （11.76）30 （88.24）6.360.012PCa7727 （35.06）50 （64.94）2.2MST1的表达与PCa临床病理特征的相关性对77例PCa患者的临床数据（包括年龄、PSA水平、TNM临床分期、Gleason评分及转移状态）进行回顾性分析，并根据转移状态将患者分为无转移组（71例）和有转移组（6例）。通过χ2检验分析MST1表达与各临床病理参数及转移之间的关系。结果显示，在无转移组中，49例MST1呈阳性，阳性率为69.01%；而在有转移组中，仅1例MST1呈阳性，阳性率为16.67%。统计分析表明，MST1的表达水平与PCa患者的转移状态显著相关（P=0.033），而与年龄、术前PSA水平、Gleason评分及TNM分期无显著关联（均P0.05）（表2）。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.06.009.T002表2MST1的表达与PCa临床病理特征的关系 ［n （%）］Tab. 2Relationship between MST1 expression and clinical pathological features of PCa ［n （%）］CharacteristicnExpression of MST1 in PCaχ2 valueP valueNegative expressionPositive expressionAge （years）≤704314 （32.56）29 （67.44）0.2540.604703413 （38.24）21 （61.76）PSA at initial diagnosis （mg/L）203412 （35.29）22 （64.71）0.0010.970≥204315 （34.88）28 （65.12）Gleason score≤74015 （37.50）25 （62.50）0.2170.64273712 （32.43）25 （67.57）TNM stageⅠ-Ⅱ5216 （30.77）36 （69.23）1.2940.255Ⅲ-Ⅳ2511 （44.00）14 （56.00）MetastasisNo7122 （30.99）49 （69.01）4.5450.033Yes65 （83.33）1 （16.67）2.3不同阶段PCa细胞中MST1的表达本研究选取RWPE-1细胞作为正常前列腺上皮细胞模型，LNCaP细胞代表激素依赖性PCa（androgen-dependent PCa， ADPC）阶段，C4-2和22RV1细胞代表CRPC阶段，以探讨MST1在PCa不同发展阶段的表达情况。图2A和图2B分别显示了MST1在各细胞株中的mRNA和蛋白表达水平。结果表明，与正常前列腺上皮细胞RWPE-1相比，PCa细胞中的MST1 mRNA和蛋白表达降低。Western blot结果显示，MST1在RWPE-1中表达最高，在LNCaP、C4-2、22RV1中依次降低。此外，随着PCa向CRPC阶段发展，MST1的mRNA表达水平呈显著的线性下降趋势（F趋势=168.86，P0.001）。这一趋势表明MST1的表达可能在PCa向CRPC发展过程中发挥作用。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.06.009.F002图2PCa细胞系中MST1表达水平Fig.2The expression level of MST1 in PCa cell linesA： mRNA expression levels of MST1 in RWPE-1， LNCaP， C4-2， and 22RV1 cells； B： Protein expression levels of MST1 in RWPE-1， LNCaP， C4-2， and 22RV1 cells； *P0.05， **P0.01 vs RWPE-1 group.2.4MST1对AR的调控为探讨MST1对AR的调控作用，本研究在具有ADPC特性的LNCaP细胞及CRPC特性的C4-2细胞中进行MST1过表达实验。qRT-PCR和Western blot检测结果（图3A、3B）显示，MST1在LNCaP和C4-2细胞中成功过表达。进一步分析发现，与对照组相比，MST1过表达显著降低了PCa细胞中AR的表达水平。其中，在MST1过表达的LNCaP和C4-2细胞中，AR的mRNA水平分别下降47.83%（t=72.31， P0.000 1）和70.37%（t=219.51， P0.000 1）（图3C），AR蛋白表达水平分别下降79.21%（t=391.52， P0.000 1）和88.02%（t=507.64， P0.000 1）（图3D），表明MST1对PCa细胞AR表达具有抑制作用，并在不同阶段的PCa细胞中表现出相似的调控趋势。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.06.009.F003图3MST1对PCa细胞中AR表达的影响Fig.3The effects of MST1 on the expression of AR in PCa cellsA： The transfection efficiency of LNCaP and C4-2 cells transfected with MST1 overexpression plasmid was detected by qRT-PCR； B： The transfection efficiency of LNCaP and C4-2 cells transfected with MST1 overexpression plasmid was detected by Western blot； C： mRNA expression level of AR in the MST1-overexpressed PCa cells； D： Protein expression levels of AR in the MST1-overexpressed PCa cells； ****P0.000 1 vs LNCaP/Vector group；####P0.000 1 vs C4-2/Vector group.2.5MST1对PCa细胞增殖和迁移的影响细胞增殖实验结果表明，与C4-2/Vector对照组相比，随着培养时间的延长，48、72 h时C4-2/MST1比C4-2/Vector组的增殖速率降低 （t=17.00、18.08，均P0.000 1）（图4A），表明MST1过表达可显著抑制PCa细胞的增殖能力。此外，迁移实验结果显示，过表达MST1后，跨孔迁移的C4-2细胞数量与C4-2/Vector组相比减少了53.61%（t=4.54，P=0.001 2）（图4B）。该结果表明，MST1过表达不仅抑制PCa细胞的增殖，还削弱其迁移能力。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.06.009.F004图4MST1对C4-2细胞的增殖和迁移能力的影响Fig.4The effects of MST1 on the proliferation and migration ability of C4-2 cellsA： The effects of overexpression of MST1 on proliferation of C4-2 cells was detected by CCK-8 assay； B： The effects of MST1 overexpression on the migration ability of C4-2 cells was detected by Transwell assay； **P0.01， ****P0.000 1 vs C4-2/Vector group.2.6MST1对PCa血管生成的影响图5显示，在MST1过表达的LNCaP和C4-2细胞中，VEGF的mRNA水平（图5A）下降（LNCaP组：t=120.14，P0.000 1；C4-2组：t=39.06，P=0.000 7）和蛋白表达水平（图5B）均显著下调（LNCaP组：t=63.28，P=0.000 2；C4-2组：t=55.59，P=0.000 3）。此外，血管生成实验结果表明，与对照组相比，MST1过表达组形成的新毛细血管样管腔结构长度缩短（t=3.50， P=0.024 8）（图5C）。综合上述结果，本研究表明MST1的过表达可抑制PCa细胞VEGF的表达，并抑制血管生成过程，从而可能降低PCa的侵袭和转移风险。10.19405/j.cnki.issn1000–1492.2026.06.009.F005图5MST1对PCa血管生成能力的影响Fig.5The effects of MST1 on the angiogenesis ability of PCaA： mRNA expression level of VEGF in the MST1-overexpressed PCa cells； B： Protein expression level of VEGF in the MST1-overexpressed PCa cells； C： The HUVEC angiogenesis assay using the supernatant from C4-2 cells ×400； ####P0.000 1 vs LNCaP/Vector group； *P0.05， ***P0.001 vs C4-2/Vector group.3讨论Hippo信号通路作为经典的抑癌通路，近年来已成为研究热点，MST1作为Hippo信号通路的核心蛋白激酶，已被证实在多种肿瘤中起到抑制作用。Gu et al［8］的研究显示，抑制MST1可能促进肝癌细胞的增殖。已有研究［9–11］表明，MST1在胃肠道肿瘤、软组织肉瘤及肺癌中呈低表达，但其在PCa中的表达水平及具体作用尚不明确。此外，MST1的表达与乳腺癌患者的生存率和预后密切相关［12］。本研究围绕“MST1在PCa中的表达-临床相关性-功能效应-候选下游分子”进行了系统探索。系统性地揭示了MST1在PCa中的表达特征及其生物学功能，结果显示其表达缺失与与PCa患者疾病的转移有关。MST1在发生转移行为的PCa组织的阳性表达率显著低于无转移行为的PCa组织，且随着PCa疾病进展，MST1蛋白表达水平逐渐降低，该发现为MST1在PCa中发挥重要抑癌作用提供了组织学与临床相关性证据。此外，本研究通过对不同阶段PCa细胞系的分析发现，MST1的表达水平随着PCa由激素依赖阶段向去势抵抗阶段发展而逐渐下降。因此，MST1表达的逐级降低可能为PCa细胞在雄激素剥夺治疗压力下获得生存和进展优势提供分子基础。AR在PCa发生发展及去势抵抗性转化过程中占据核心地位，其异常激活被认为是CRPC的重要驱动因素，这些变化包括AR配体结合结构域突变、AR过度表达以及AR剪接变异体，后者在雄激素剥夺治疗持续抑制雄激素的情况下仍能恢复AR信号［13］。近年来研究［14］显示，Hippo-YAP 信号通路与AR之间可能存在交叉调控关系，从而共同影响PCa细胞的生物学行为。本研究结果显示MST1过表达可在LNCaP与C4-2细胞中显著下调AR的mRNA与蛋白水平，提示MST1可能影响AR相关表型。本研究结果提示MST1表达变化可能与AR信号轴的活性状态相关，为后续深入研究二者之间的相互作用提供了实验依据。VEGF作为关键的促血管生成因子，与肿瘤的恶性进展密切相关。研究［15］结果显示，VEGF在PCa组织中的表达显著提升，且与PCa的浸润范围、转移倾向及预后具有强关联性。已有研究［16］表明，Hippo-YAP 通路的异常激活可通过多种方式参与血管生成调控。本研究表明，MST1过表达可伴随VEGF表达水平下降，并在体外血管生成实验中表现为新毛细血管管腔样结构形成能力减弱。提示MST1可能通过影响促血管生成因子参与PCa血管生成过程，为血管生成抑制剂和靶向药物的研制提供新的位点和思路。结合Hippo-YAP通路在血管生成调控中的相关研究线索，MST1-Hippo/YAP-VEGF轴值得进一步深入机制验证，尤其需要通过体内血管生成与转移模型来确认其因果关系。此项工作可能成为后续研究的重点。在功能层面，本研究显示MST1过表达可抑制PCa细胞增殖与迁移能力，从细胞水平上支持了MST1在PCa中可能具有抑制恶性生物学行为的潜在作用。本研究存在一定局限性。本研究主要基于体外细胞模型，尚缺乏体内动物实验验证MST1的抑癌作用及其对肿瘤生长、转移的影响。此外，本研究未深入探究MST1对AR、VEGF的分子调控机制，如MST1是否通过Hippo-YAP信号通路调控这些分子的转录，或是否存在其他中间调控因子。尽管存在上述局限性，本研究结果仍为MST1在PCa中的作用提供了重要的实验证据，为后续深入研究奠定基础。